一、荧光标记寡核苷酸探针检测变形链球菌（论文文献综述）
关乃瑜[1]（2021）在《基于AuNPs-寡聚核苷酸探针的草甘膦免疫学检测技术研究》文中进行了进一步梳理草甘膦（glyphosate,GLYP）是由美国孟山都公司在二十世纪60年代开发一种非选择性广谱除草剂。自2005年以来,GLYP的销量稳居全球农药销售排行榜首位。1995年首株GLYP抗性大豆系培育成功,此后GLYP的生产量与使用量逐年锐增。目前,GLYP已成为世界上应用最广、生产量最大的除草剂,也是目前我国使用量最大的除草剂。GLYP的长期大量施用导致环境及农作物中具有高水平的GLYP残留,对生态环境和人类健康构成了严重的威胁。2015年,世界卫生组织国际癌症研究机构将GLYP归类为2A类致癌物,即对人类可能致癌的物质。所以开发快速、灵敏、高效的GLYP检测技术对于保障农产品食品安全至关重要。GLYP的传统检测方法主要以色谱技术为主,尽管该方法具有较高检测灵敏度,但仍存在样品前处理步骤复杂,分析成本高,检测周期长和仪器设备昂贵等不足。因此,开发选择性好、灵敏度高、方便、价格低廉的GLYP快速检测方法是保障食品安全的迫切需求。与其他检测技术相比,免疫学检测技术具有检测周期短、成本低、操作简便等优势。然而,现有的GLYP免疫学检测方法则以传统的酶联免疫分析方法（ELISA）为主,相比于色谱法等仪器分析方法,ELISA的检测灵敏性较低。近年来,随着新型纳米材料和生物酶的出现,免疫分析技术快速发展,已经成为一个融合纳米技术、酶工程和基因工程等其他多学科交叉的新型分析技术,为开发更加快速、灵敏、特异的免疫学分析方法提供了新的观点和思路。基于生物功能化纳米粒子材料的新型免疫分析技术,可进一步提高免疫学检测方法的灵敏性和稳定性,弥补现有的GLYP免疫学检测方法灵敏性低、检测步骤多、检测方法单一等不足。本课题旨在结合免疫学检测技术、荧光分析技术和分子探针标记技术,利用寡聚核苷酸和金纳米粒子（AuNPs）在生物传感领域的应用优势,以ELISA检测为基础建立基于寡聚核苷酸纳米结构功能化AuNPs探针的新型GLYP免疫学检测方法。以期提高GLYP免疫学检测方法的检测水平,实现更加灵敏、快速、经济的GLYP检测。同时探究聚核苷酸功能化AuNPs探针在GLYP等小分子物质检测中的应用潜力。本论文的具体工作内容和结论如下:1.GLYP完全抗原的合成和鉴定。分别采用活化酯法和混合酸酐法合成了GLYP的免疫抗原（BSA-GLYP）和检测抗原（OVA-GLYP）。通过UV-Vis光谱扫描、琼脂糖电泳和Native-PAGE对合成的完全抗原进行分析鉴定,通过比较不同免疫抗原免疫鼠的血清的效价及抑制率,选择具有较高血清效价和抑制率的c BSA-聚醚胺-GLYP用于制备多克隆抗体。2.GLYP多克隆抗体的制备与鉴定。采用AKTA蛋白纯化系统和A蛋白抗体纯化柱对兔血清中的GLYP抗体进行纯化,并对抗体的浓度、纯度、效价和亲和力进行测定。结果显示,抗体效价为1:256000,抗体的亲和力常数为3.68×109 L mol-1,属于高亲和力抗体。3.ic-ELISA检测方法的建立。利用制备的兔抗GLYP多克隆抗体建立检测GLYP的ic-ELISA方法。线性检测范围为0.125 mg m L-1～4 mg m L-1,最低检测限为139.9μg m L-1。建立的ic-ELISA方法检测GLYP的三种结构类似物AMPA、GLUF和PMIDA的交叉反应率分别为0.61%、0.003%和0.014%,食品样品中的回收率在97.1%～99.9%之间,检测时间为3 h。4.基于AuNPs-TDNs纳米耀斑探针的间接竞争荧光免疫分析方法（AuNP-TDNs-ic-FLIA）的建立。用羊抗兔抗体和荧光染料SYBR Green I（SG）染色的四面体DNA（TDNs）同时修饰AuNPs,制备初始荧光被AuNPs通过FRET作用淬灭的具有可控荧光开启功能的AuNP-TDNs纳米耀斑探针（AuNP-TDNs nanoflare probe）,利用AuNPs的尺度效应及较大的比表面积实现对检测信号的放大。采用TEM、UV-Vis扫描光谱和荧光光谱对制备的探针进行表征,随后基于探针建立检测GLYP的间接竞争荧光免疫分析方法（ic-FLIA）。向包被OVA-GLYP的酶标板中加入GLYP抗体与待检样品混合物后进行孵育,此时样品中的GLYP与酶标板中的OVA-GLYP竞争结合GLYP抗体。洗板后加入AuNP-TDNs纳米耀斑探针进行孵育。再次洗涤后,加入二硫苏糖醇（DTT）释放探针上的耀斑DNA（TDNs-SG）,实现荧光的恢复。结果显示,该方法的检测范围为0.5μg m L-1～32μg m L-1,最低检测线为0.18μg mL-1。灵敏度比基于同一抗体的ic-ELISA方法提高了约700倍。方法检测GLYP的三种结构类似物AMPA、GLUF和PMIDA的交叉反应率均小于0.01%,食品样品中的回收率在95.5%～100.0%之间,检测时间为3.5 h。5.基于AuNP-dsDNA纳米耀斑探针的竞争荧光免疫分析方法（AuNP-dsDNA-c-FLIA）的建立。用GLYP抗体和荧光染料SG标记的dsDNA同时修饰AuNPs,制备初始荧光被AuNPs通过FRET作用淬灭的具有可控荧光开启功能的AuNP-dsDNA纳米耀斑探针（AuNP-dsDNA nanoflare probe）,同时利用AuNPs较大的比表面积实现对检测信号的放大。采用TEM、UV-Vis扫描光谱和荧光光谱对制备的探针进行了表征,并在该探针基础上建立了检测GLYP的竞争荧光免疫分析方法（c-FLIA）。向包被OVA-GLYP的酶标板中加入AuNP-dsDNA纳米耀斑探针与待检样品的混合物后进行孵育,此时样品中的GLYP与酶标板中的OVA-GLYP直接竞争结合探针上的GLYP抗体。洗涤除去未结合组分后,加入DTT释放探针上的耀斑DNA（dsDNA-SG）,实现荧光的恢复和检测信号的放大。结果显示,该方法的检测范围为62.5 ng m L-1～4μg m L-1,最低检测线为28.6 ng m L-1。检测GLYP的三种结构类似物AMPA、GLUF和PMIDA的交叉反应率均小于0.01%,食品样品中的回收率在97.5%～101%之间。该方法的检测灵敏度比基于同一抗体的ic-ELISA和AuNP-TDNs-ic-FLIA方法分别提高了4800倍和6倍。本方法采用直接竞争的检测模式进一步简化了检测程序,将检测时间从3.5 h缩短至1.5 h,检测流程更简单、省时。同时,以dsDNA-SG代替TDNs-SG作为耀斑DNA,进一步提高了探针的信号放大性能。6.基于双功能化AuNPs的条形码检测方法的建立。用GLYP抗体和dsDNA修饰AuNPs,制备同时具有GLYP识别捕获和信号扩增放大功能的AuNPs探针。dsDNA由一条巯基修饰的捕获DNA链（SH-capture DNA）和一条互补配对结合在捕获链上的条形码DNA/信号DNA（signal DNA）组成。在该探针基础上,建立了检测GLYP的条形码扩增免疫分析方法（AuNP-BB-iPCR）。向包被有OVA-GLYP的PCR管中加入AuNPs探针和待检样品的混合物进行免疫竞争反应,在此过程中样品中的GLYP与PCR管中的OVA-GLYP竞争结合AuNPs探针上的GLYP抗体。洗涤除去未结合组分后,向管中加入PCR反应体系进行real-time PCR,通过检测signal DNA的量实现对GLYP的检测。本方法对探针制备条件进行了优化,并采用TEM、UV-Vis扫描光谱、real-time PCR和SDS-PAGE等方法对探针进行了表征。结果显示,该方法的最低检测限为8.9 pg m L-1,线性范围是122.1 pg m L-1～62.5 ng m L-1。建立的AuNP-BB-iPCR方法检测GLYP的三种结构类似物AMPA、GLUF和PMIDA的交叉反应率分别为2.36%、0.02%和0.34%。在对食品样品进行的标准品添加回收实验中,回收率在98.3%～102.9%之间。本研究利用real-time PCR对探针上条形码DNA进行PCR循环扩增实现检测信号的指数放大。灵敏度比基于同一抗体的ic-ELISA、AuNP-TDNs-ic-FLIA和AuNP-dsDNA-c-FLIA分别提高了7个数量级、4个数量级（20000倍）和3个数量级（3200倍）。检测时间为3.5 h。7.结论。本研究将纳米技术、荧光标记技术和免疫学检测技术相结合,制备基于AuNPs和寡聚核苷酸的纳米材料生物传感探针。经过探针表征、条件优化和性能评估试验后证明了探针在提高GLYP免疫学检测方法的灵敏性方面的有效性。并在此基础上开发了检测GLYP的一种ic-ELISA方法和三种新型免疫学检测方法。除了ic-ELISA方法以外,其他三种方法的灵敏性均满足我国国家标准中对食品中的GLYP最大残留限量的检测标准要求。相比于国标中规定的食品中GLYP残留量测定的GC-MS标准方法,本方法不需要特殊的检测条件和昂贵的仪器,仅需要简单的孵育步骤即可在1.5 h～3.5 h内完成检测,成本低廉、操作简单。
李佳[2]（2021）在《DNA/Hemin模拟酶催化性能研究及其生物分析应用》文中研究说明DNA酶是一种重要的人工模拟酶,具有分子量小、易合成、低成本、热稳定性高、可编程等优势,在疾病精准诊断、分子影像、肿瘤诊疗等领域具有广泛的应用前景。然而,目前DNA模拟酶的催化性能与蛋白酶相比仍有一定的差距,极大限制了其应用。因此,提高模拟酶的催化性能,构建高效、稳定的DNA酶是DNA模拟酶相关研究中的关键问题。本论文整合临床检验诊断学、生物分析化学以及纳米科学等多学科最新研究成果,深入探讨了DNA/氯化血红素（Hemin）模拟酶的催化活性和反应机理;发展了一系列具有高效催化能力、性质稳定、环境耐受力强的DNA酶;建立了基于DNA酶的核酸、小分子、细胞膜蛋白等多种疾病标志物高灵敏检测新方法。本研究不仅为无酶检测体系提供了新的理论和技术支持,而且为人工模拟酶的开发提供了新思路。本研究主要包括以下三个部分:1.DNA-Hemin酶与传统G4/Hemin酶的荧光催化性能对比分析以Hemin与寡核苷酸链共价结合为基础的模拟酶（DNA-Hemin酶）作为生物传感应用中的催化剂引起了研究者的广泛关注,然而其结构变构模式和催化性能仍然需要进一步探究。本研究提出了一种概念类比分析策略,比较DNA共价结合的Hemin酶（DGH）与经典G-四链体/氯化血红素（G4/Hemin）酶催化和分析性能。首先设计了两个类似的靶标触发催化活性的荧光催化体系,比较二者作为分子识别探针和催化剂的无酶荧光传感分析性能。结果表明,尽管G4/Hemin表现出更好的催化能力,但DGH具有背景低,催化速率快,耐受性好和靶标触发构象转换效率高等优点。此外,以miRNA-21作为模型分析物时,DGH体系的最低检测限为0.17 nM,约为G4/Hemin的20倍,表明DGH体系在荧光生物传感策略中具有更好的灵敏度和剂量响应能力。因此,DGH酶是一种出色的无酶信号转导工具,具有广阔的应用前景。2.动态DNA自组装激活的DNA-Hemin酶系统的荧光生物传感应用本研究建立了动态DNA自组装激活的Hemin模拟酶系统,实现多功能的荧光生物传感检测。与DNA共价结合的Hemin探针不仅可以作为动态DNA自组装的模块,还充当可调谐的模拟酶工具。当靶标存在时,熵驱动的动态DNA组装启动回路,将标记于DNA链末端的活性钝化的Hemin二聚体解离为活化的单体,使得激活的DNA-Hemin模拟酶可以催化无荧光的酪胺底物产生荧光信号,实现简单、快速、无酶的检测。该策略适用于多种靶标的检测:检测核酸靶标-GBS基因时,最低检测限和线性范围分别为78 pM和0.1-50 nM,检测时间为40分钟;检测小分子靶标可卡因时,检测限为4.85μM,检测时间为70分钟。该检测系统的优点在于可调谐的模拟酶激活机制,仅需设计简单的DNA组装寡核苷酸模块,无需添加额外Hemin的快速组装等。本工作提出的简单、通用的靶标触发激活的DNA-hemin酶系统可实现高效的无酶信号转导,有望成为广泛应用的生物传感工具。3.拉链式组装的高效DNA酶催化性能研究及其生物分析应用G4/Hemin酶能够模拟辣根过氧化物酶（HRP）的催化活性,被广泛应用于生物传感、生物医学工程以及疾病诊疗等领域,成为不可或缺的人工模拟酶系统。然而,如何进一步提高其催化性能,使其能与蛋白酶相媲美,仍是研究人员不断追求的目标。本工作在前期研究基础上,构建了一种基于邻位组装的新型G4/hemin DNA酶,具有出色的HRP模拟催化特性,称之为拉链式组装的DNA酶（Z-G4/H）。Z-G4/H催化活性和机制的研究结果揭示其组装模式（与Hemin共价结合的寡核苷酸链（DNA-Hemin）与包含G4序列和腺嘌呤核苷酸的互补链的杂交互补）高度模拟蛋白酶辅因子和酶蛋白紧密结合的构型。与传统的离子依赖型组装的G4/Hemin DNA酶相比,Z-G4/H体系具有催化活性高,催化速率快,环境依赖性低,环境耐受力强等优点。此外,基于Z-G4/H酶构建的体系实现了BCR-ABL融合基因和乳腺癌细胞表面人类表皮生长因子受体2（HER2）二聚体高灵敏检测,充分证明了Z-G4/H酶在疾病标志物检测、体内生物大分子相互作用研究等领域具有广阔的应用潜力。本工作提出的拉链式组装的G4/Hemin DNA酶为开发与天然蛋白酶相当的模拟酶提供了新的启发和机会。
李玉武[3]（2021）在《尿路感染病原菌分布和耐药性分析及PCR-量子点荧光技术在尿路感染病原菌鉴定中的应用》文中指出目的:1、通过对尿培养4086株病原菌分布和耐药性回顾性分析,筛选尿路感染常见病原菌,并为本地区尿路感染抗菌药物合理应用提供依据。2、应用PCR-量子点荧光法检测19种尿路感染常见病原菌,并与尿培养和Sanger测序等检测方法比较分析,为临床尿路感染病原菌鉴定提供快速准确的检测方法。方法:1、选取2019年01月至2019年12月苏北人民医院4086例尿液培养阳性结果使用WHONET 5.6版软件进行统计分析,并采用SPSS 22.0统计软件对数据进行统计学分析。2、收集2020年8月至2020年12月于苏北人民医院进行尿细菌培养患者的清洁中段尿标本,按照相应纳入和排除方案筛选出465例患者的清洁中段尿标本。将筛选出的465例尿液标本分别进行PCR-量子点荧光法检测和尿液细菌培养（尿培养阳性结果分别进行鉴定卡和质谱对病原菌鉴定）,比较PCR-量子点荧光法和尿培养结果的一致性。当PCR-量子点法与尿培养结果不一致时,采用Sanger测序对病原菌进行鉴定。结果:1、4086株尿路感染病原菌,主要为G-菌,共检出2835株（占比69.4%）。检出率较高的G-菌依次为大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌和弗氏柠檬酸杆菌,构成比分别为52.6%、16.0%、8.4%、5.6%、3.9%、2.3%、1.3%。检出G+菌826株（占比20.2%）,主要为屎肠球菌和粪肠球菌,构成比分别为40.6%和26.4%,其后依次为表皮葡萄球菌9.8%、无乳链球菌8.0%、金黄色葡萄球菌4.6%。真菌检出425株（占比10.4%）,以白色念珠菌为主,构成比为70.6%。2、G-菌、G+菌、真菌在不同就诊类型（χ2=83.975,P<0.001）、年龄（χ2=21.558,P=0.001）、性别（χ2=126.437,P<0.001）、科室（χ2=12.687,P=0.013）中的检出率存在明显差异。3、耐药性分析显示,大肠埃希菌对阿米卡星、碳青霉烯类、多粘菌素的耐药率分别为1.6%、1.1-1.4%、1.3%。大肠埃希菌对头孢类（除头孢替坦外）和喹诺酮类耐药率分别高于53.0%和60.0%。肺炎克雷伯杆菌对阿米卡星、多粘菌素、替加环素耐药率均低于10.0%。屎肠球菌、粪肠球菌均未检出对利奈唑胺和替加环素耐药,对万古霉素产的耐药率均低于1.0%,对替考拉宁的耐药率均低于10.0%。4、应用PCR量子点荧光法检测465例尿液标本,除化脓链球菌未检测出外,其余18种病原菌（包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞杆菌、鲍曼不动杆菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、白色念珠菌、解脲支原体、沙眼衣体、奈瑟淋球菌、生殖支原体）均有检出。5、纳入的465例标本经尿培养或PCR量子点法检测,404例标本结果为阳性,61例标本结果为阴性。尿培养和PCR量子点法结果均为阳性403例,PCR量子点法和尿培养阳性符合率为100.0%;1例标本PCR量子点荧光法报告为解脲支原体感染而尿培养为阴性,二者均阴性61例,PCR量子点法和尿培养阴性符合率98.4%。6、在404例阳性结果中:304例培养和PCR均报告单一病原菌;1例标本PCR量子点荧光法报告为单菌感染,尿培养为阴性;99例标本报告有多菌感染。多菌感染标本中:3例标本PCR和培养均报告为多菌感染;96例标本PCR量子点荧光法报告为多菌感染而尿培养报告为单菌感染。7、96例PCR量子点荧光法报告为多菌感染而尿培养报告为单菌感染的标本:其中27例标本结果为非性病病原菌多菌感染,2例非性病病原菌多菌合并性病病原菌感染为,对这29例标本的DNA提取物进行Sanger测序,结果与PCR量子点荧光法结果一致;67例为非性病病原菌单菌合并性病病原菌感染。8、465例标本经PCR量子点荧光法检测,70例标本（包括69例多菌感染标本和1例单菌感染标本）检测出解脲支原体、沙眼衣原体、生殖支原体或淋病奈瑟球菌,经Sanger测序,结果与PCR量子点荧光法结果一致。结论:1、尿路感染主要病原菌为革兰氏阴性菌,以大肠埃希菌为主。大肠埃希菌对头孢菌素、喹诺酮类抗生素的耐药率较高,因此药敏结果报告前,不提倡常规使用此类抗菌药物。2、病原菌的分布在不同性别、就诊类型、年龄、科室分布存在差异,经验性用药治疗时应更具针对性。3、PCR量子点荧光法比尿培养有较快的鉴定速度,可在尿液标本中对解脲支原体、沙眼衣原体、生殖支原体和淋病奈瑟球菌进行快速鉴定。4、PCR量子点荧光法比尿培养能更好地检测多菌感染,且对多菌感染病原菌鉴定具有较高的准确性。
张亚青[4]（2020）在《基于荧光共振能量转移的食源性致病菌检测方法研究》文中研究说明食源性致病菌是指以食品为传播媒介可侵犯人体引起感染甚至传染病的病原微生物,它所引起的食品安全问题和感染性疾病等一系列问题一直是威胁人类健康的巨大隐患。常见的致病菌如大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）极易引发细菌性食物中毒,严重者甚至会危及人类生命。因此针对于食源性致病菌的快速高效检测方法的研发对食品安全风险防控和人类细菌传染性疾病的预防具有重要意义。然而传统的微生物检测方法耗时费力,快速检测方法如聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）、酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）等存在着操作复杂、仪器材料昂贵、假阳性高等局限性。因此,发展一种简单、快速、灵敏、高选择性的检测手段对致病菌进行监控具有十分重要的现实意义。本文基于量子点（quantum dots,QDs）和纳米金（gold nanoparticles,AuNPs）优良的光学性质,建立了基于核酸适配体（Aptamer）的特异性识别及凝集素或抗生素的广谱识别的双分子识别的荧光共振能量转移（Forster resonance energy transfer,FRET）传感器用于检测食源性大肠杆菌和细胞内金黄色葡萄球菌,主要内容如下:工作一:本工作主要利用廉价易得的生物分子凝集素刀豆蛋白A（concanavalin A,Con A）作为稳定剂,NaBH4为还原剂,一锅法还原HAuCl4得到刀豆蛋白A修饰的金纳米颗粒（Con A-AuPNs）。该合成方法简单、快速（约40 min）,合成产物Con A-AuPNs均匀分散,在518nm处有特征吸收,有较高的吸光系数。将E.coli作为待检致病菌模型,基于凝集素和适配体的双重识别,以特异性适配体修饰的量子点（Aptamer-QDs）作为能量供体（发射波长在525nm）、Con A-AuPNs为FRET能量受体,构建了FRET传感器在0.5 h内实现了对E.coli的定量检测。其线性范围为1022×108 cfu/mL,检测限为45 cfu/mL。将该策略用于检测真实样品牛奶和橙汁中的E.coli时,回收率为83.1%112.5%,相对标准偏差为0.050.50%,具有潜在的实用价值。本工作建立的简便、快速、特异性的致病菌检测通用方法对于食品安全的有效监控具有重要意义。工作二:本工作以S.aureus特异性适配体修饰的量子点（Aptamer-QDs）和一锅法合成的抗生素替考拉宁（Teicoplanin,Teico）修饰的金纳米颗粒（Teico-AuNPs）分别作为能量转移的供体和受体构建FRET传感器检测S.aureus。构建细胞（RAW 264.7）内S.aureus侵染模型,通过共聚焦显微镜和平板涂布的方式证明了S.aureus在RAW 264.7细胞内存活。该FRET传感器能在2 h内有效检测RAW 264.7细胞内S.aureus,且对于不同程度的S.aureus侵染的RAW 264.7细胞有明显的荧光信号区分,在判断细胞细菌感染程度上有一定的潜在应用价值。本工作建立了简便、特异、省时且适用于大量样品分析的细胞内S.aureus检测方法,对食源性动物细菌感染性疾病的诊断和指导治疗有着潜在意义。
杨双双[5]（2020）在《基于核酸适配体和纳米材料的鲍曼不动杆菌检测新方法研究》文中研究指明鲍曼不动杆菌是临床最常见的非发酵革兰阴性菌,广泛存在于医院环境中,已成为引起呼吸机相关性肺炎、血流感染、腹腔感染和术后伤口感染等院内感染的主要病原菌之一,感染致死率高达20%。然而,现有检测方法如传统培养鉴定、质谱分析、PCR扩增以及基因测序等,或耗时长、灵敏度低,或需要特殊仪器设备、检测成本高,因此,亟需研发快速、灵敏、普适的鲍曼不动杆菌检测新方法,而随着生物技术和纳米技术的飞速发展,新型生物传感器的出现,为病原微生物的体外诊断带来了契机。核酸适配体（Aptamer,Apt）是一种功能核酸,可特异性识别蛋白、核酸、药物、代谢小分子以及病原微生物等靶标,具有结合能力强、稳定性高以及易于合成和修饰的优点,已广泛用于构建生物传感器。与此同时,借助纳米材料例如:贵金属材料、磁性材料、金属有机骨架材料以及上转化发光材料等的多功能性、良好的生物相容性以及优越的生物活性（如催化活性、光敏活性以及抗菌活性等）,生物传感器的分析性能得到大幅度提升,使基于核酸适配体和纳米材料的适体传感器（Aptasensor）,在临床病原微生物检测领域的应用前景变得更为广阔。但是,目前用于病原微生物检测的适体传感器仍存在核酸适配体与纳米材料结合不稳定,结合效率低以及检测灵敏度不足等问题。为了解决上述问题,本论文基于核酸适配体、金属有机骨架纳米材料和CRISPR-Cas生物材料的优势,通过探讨Zr-MOF纳米材料和CRISPR-Cas12a生物材料介导的两种信号放大机制,构建新型荧光适体传感器;并以鲍曼不动杆菌为靶标,验证荧光适体传感器在临床重要病原菌检测中的应用价值。具体内容分为三大部分:1 Zr-MOF纳米材料的信号放大机制研究信号放大效率是影响生物传感器检测灵敏度的关键。金属有机骨架（Metal organic frameworks,MOFs）是无机金属离子和有机配体通过配位键组装合成的晶型杂化材料,具有多孔性、结构可调、功能多样和易于修饰的特性。近年来,国内外研究团队基于MOFs纳米材料（如ZIF-8、MIL-101以及PCN-224等）信号放大策略构建的生物传感器,已实现了对多种生物靶标的灵敏检测,但是,锆基MOFs（Zr-MOFs）作为分析化学中常用的MOFs材料之一,在生物标志物检测方面的应用尚处于起步阶段。通过深入挖掘Zr-MOFs的多功能性,我们发现Zr-MOFs中Zr金属离子可与生物分子中的磷酸根特异性结合,故推测当大量的磷酸根离子存在时,磷酸根与Zr-MOFs中的有机配体竞争性结合Zr金属离子,可能引起Zr-MOFs骨架结构的破坏;基于这一推测,在Zr-MOFs中负载信号分子,合成信号探针,利用高浓度磷酸根离子破坏Zr-MOFs的骨架结构,释放信号分子,有望实现信号放大。为验证这一推测,我们首先利用Zr金属离子和NH2-BDC配体的配位效应合成了一种常用的Zr-MOF纳米材料即UIO-66-NH2,并发现经不同浓度的Na2HPO4处理后,UIO-66-NH2的NH2-BDC配体在426 nm波长处的荧光强度发生不同程度的改变,且随着Na2HPO4浓度的升高,NH2-BDC配体的荧光强度进行性增强,提示磷酸根可竞争性结合UIO-66-NH2中Zr金属离子,使UIO-66-NH2释放NH2-BDC配体,且该竞争性结合效应具有浓度依赖性。进一步地利用UIO-66-NH2的多孔性包被有荧光素F（F@UIO-66-NH2）并经1M Na2HPO4（含高浓度磷酸根离子）处理5分钟后,UIO-66-NH2典型的八面体结构和晶型被完全破坏,响应性释放其孔道内负载的荧光素F,导致荧光素F在512nm波长处的荧光强度迅速增强。因此,基于UIO-66-NH2的多孔性及其在Na2HPO4缓冲液中结构的不稳定性,合成Na2HPO4响应性信号探针、构建生物传感信号放大体系,具有充分的可行性。同时,由于F@UIO-66-NH2响应性释放荧光素F的行为具有Na2HPO4浓度依赖性,使该响应性释放体系具有可调节性。在低浓度Na2HPO4作用下,表现为“缓慢释放”,而在高浓度Na2HPO4作用下,表现为“突发释放”。这种特性将为Zr-MOFs在生物传感、生物成像及靶向纳米治疗等研究领域的应用提供重要的理论依据和全新的研究思路。2基于Zr-MOF的荧光适体传感器用于检测鲍曼不动杆菌在证实了UIO-66-NH2信号放大机制的基础上,我们在Fe3O4（磁核）表面原位生长UIO-66-NH2,合成了核-壳结构的新型磁性Zr-MOF纳米材料（Zr-mMOF）,利用UIO-66-NH2的Zr金属位点可通过Zr-O-P共价键牢固结合磷酸根的特性,将磷酸根标记的鲍曼不动杆菌特异性核酸适配体（p-Ab-Apt）高效修饰在Zr-mMOF表面,合成磁性捕获探针Zr-mMOF-p-Ab-Apt,增强了核酸适配体二级结构的稳定性,克服了现有适体传感器存在的核酸适配体与纳米材料结合不牢、效率不高以及在临床样本检测中性能不稳定的缺陷,使得Zr-mMOF-p-Ab-Apt的核酸适配体修饰效率高达93.30%,捕获效率可达84.92%-96.79%且捕获特异性可达93.08%-94.31%,优于免疫修饰法或化学修饰法构建的磁性捕获探针。进一步地用UIO-66-NH2负载荧光素F,并在其表面修饰磷酸根标记的细菌细胞壁脂多糖（LPS）的核酸适配体（p-LPS-Apt）,构建信号探针（F@UIO-66-NH2-p-LPS-Apt）,核酸适配体修饰效率达93.0%。不仅稳定了核酸适配体的二级结构,还使得p-LPS-Apt在UIO-66-NH2表面形成“核酸分子开关”,封闭其内孔道内的荧光素F,避免荧光素F的外溢,降低背景信号。最后,采用双适体夹心策略,将捕获探针和信号探针先后与鲍曼不动杆菌共孵育后,利用1M Na2HPO4溶液破坏捕获探针/细菌/信号探针复合物中UIO-66-NH2的晶体结构,响应性释放荧光素F,实现信号放大,成功构建新型荧光适体传感器。该荧光适体传感器可在2.5小时内完成血液标本中鲍曼不动杆菌的检测,线性范围为101-105 CFU/mL,最低检测限为10 CFU/mL。本研究在证明UIO-66-NH2信号放大机制的基础上,深入挖掘Zr-MOF（UIO-66-NH2）的多功能性,创新性地探索了Zr-MOF同时作为捕获探针和信号探针的可行性及其机制。而且,通过改变探针中核酸适配体的序列,可实现对不同病原微生物如细菌、病毒、真菌等的快速、灵敏、特异地富集和检测。由此可见,本部分构建的荧光适体传感器具有通用性,在临床病原微生物的体外诊断中具有潜在应用价值。3基于CRISPR-Cas12a的荧光适体传感器检测鲍曼不动杆菌在感染初期,患者体内鲍曼不动杆菌的细菌载量较低,尤其是在血流感染初期,血液中鲍曼不动杆菌的细菌载量往往低于10 CFU/mL,而上述基于Zr-MOF和核酸适配体构建的荧光适体传感器的检测限为10-100 CFU/mL。同时,由于微米级的细菌和纳米级的MOF材料之间可能存在空间位阻效应,限制了双适体纳米探针与细菌的结合,影响检测灵敏度。因此,我们进一步利用比细菌和纳米材料体积小的蛋白或核酸等生物活性分子,减少潜在的空间位阻效应,建立更为高效的信号放大体系,以期提高荧光适体传感器的灵敏度。CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌的生物免疫防御机制,而随着LbaCas12a核酸酶的特异性靶向和顺、反式切割核酸的特性被先后报道,国内外研究团队陆续利用LbaCas12a核酸酶的这两大特性成功构建DETECTR、HOLMES等CRISPR-Cas12a分子诊断技术,实现了对核酸以及单核苷酸多态性的单分子检测。但是,CRISPR-Cas12a技术在非核酸类生物靶标检测中的应用价值尚不清楚,且该系统与核酸适配体、纳米材料的整合应用价值尚不明确。因此,我们进一步探讨了核酸适配体、功能纳米磁珠和CRISPR-Cas12a系统在临床病原微生物单分子检测中的整合应用价值。首先,采用生物素-链霉亲和素的非共价结合方式,将生物素修饰的鲍曼不动杆菌特异性适配体（Ab-Apt-biotin）连接在链霉亲和素功能化的磁珠（MB）表面,随后将互补序列c-Ab-Apt通过碱基互补配对结合在Ab-Apt-biotin上,合成捕获探针DNA activator@MB;同时,以c-Ab-Apt为靶标,设计CRISPR-Cas12a荧光信号放大体系;最后,利用核酸适配体竞争性触发策略,构建新型荧光适体传感器。该荧光适体传感器可在1.5小时内完成鲍曼不动杆菌检测,线性范围为101-105 CFU/mL,最低检测限为3 CFU/mL,初步实现了单分子检测,显着提高了方法的检测灵敏度。同时,在临床血清中加入0.1 Unit/mL的RNase抑制剂后,该方法检测血清样本中鲍曼不动杆菌的相对荧光信号仍可达到87%,提示该方法在鲍曼不动杆菌感染早期诊断中具有潜在的应用价值。本研究创新性地将磁性适体探针对临床病原菌的检测信号成功转化为核酸信号,触发CRISPR-Cas12a信号放大体系,实现对临床病原菌的单分子检测,为CRISPR-Cas12a在非核酸生物靶标检测中的应用提供了新的研究策略。
张露灏[6]（2020）在《脂质-DNA复合结构的细胞应用》文中研究表明受体-配体相互作用在细胞的信号转导,新陈代谢和生长方面发挥着重要的作用。对于不同的细胞或细胞的不同状态,受体的种类和数量存在巨大的差异。虽然一些具有靶向性的分子探针能够可视化细胞膜上受体的分布,甚至实现肿瘤的诊断和靶向治疗,但针对内源性受体,筛选和设计具有正交性的受体-配体相互作用仍然面临着巨大的挑战。DNA链能通过Watson-Crick碱基互补配对原则杂交,并能通过改变碱基的种类和数目设计不同的DNA链。因此该过程具有高度的特异性和可编程性,理论上可以设计无限组正交相互作用对。本工作是通过DNA框架核酸编码并模拟具有正交性的受体-配体相互作用体系,并将该体系应用于细胞的模式识别,多价配体-受体相互作用研究,基于活细胞的细胞计算网络的构建。具体内容如下:第一,通过细胞膜表面DNA编码生物模拟的受体-配体相互作用体系,实现不同细胞的模式识别。胆固醇修饰的单链DNA能够插入细胞膜上,我们将锚定在细胞膜上的DNA链称为人工受体（ADR）。细胞质膜上分布着大量胆固醇,通常集中在与细胞内化作用相关的小窝蛋白结构域和脂筏。我们将带有手臂链的四面体DNA框架核酸（TDF）作为配体,其能通过碱基互补配对与互补的ADR结合。我们对ADR-TDF配体相互作用的正交性进行验证,发现ADR-TDF配体的相互作用具有正交性。受体在细胞膜上的分布通常受内化作用的影响,我们研究了哪个内化途径会对ADR-TDF配体的分布产生影响。发现ADR-TDF配体在细胞上的分布主要受温度和小窝蛋白依赖的内化途径的影响。由于不同细胞膜受体分布的动力学存在差异,从而导致不同ADR-TDF配体相互作用模式。因此,可以通过模式识别的方法,区分不同的细胞系。第二,基于第一部分内容建立的ADR-TDF配体相互作用体系,我们研究了多价的TDF配体与ADR相互作用的关系。带负电的DNA结构通常能与细胞膜表面的清道夫受体（SR）产生相互作用。我们用SR的抑制剂聚肌苷处理细胞后,发现ADR阴性细胞对TDF的内化受到明显的抑制,但ADR阳性细胞对TDF的内化几乎不受影响,表明ADR介导TDF配体的内化独立于天然的SR受体介导TDF配体的内化。通过全内反射显微镜,我们在单分子水平记录下了ADR或SR与TDF配体的相互作用过程。我们发现ADR与TDF配体相互作用的时间明显比SR与TDF配体相互作用的时间长,表明ADR与TDF配体的亲和力更高。TDF配体是三维结构,通过改变手臂链的位置和数量,可以构建价态和取向不同的TDF配体。我们发现价态和取向都会影响TDF配体的内化,价态越高,TDF配体的内化效率更高,并且对位的取向能提高配体的内化效率。利用价态对内化的影响,我们构建了加权运算体系,根据TDF配体的价态和浓度,控制不同价态TDF配体的内化效率。第三,根据ADR-TDF配体系统,构建了细胞计算逻辑线路。我们以活细胞为基质,实现了“与”门和“或”门的逻辑运算。我们根据设计加入作为输入信号的DNA链,当细胞内出现荧光信号时,输出为“1”,否则输出为“0”。我们进一步通过载有阿霉素（Dox）的TDF结构Dox@TDF,实现了根据逻辑线路调控的药物递送。该线路使用“非”门逻辑运算,当没有输入信号时,细胞正常生长,输出为“1”,当有输入信号时,细胞生长受到抑制,输出为“1”。总的来说,利用DNA编码的受体-配体相互作用系统,能够实现细胞的分类,多价相互作用模型和细胞计算线路的构建。相较于基于蛋白质的受体-配体相互作用系统,DNA编码的配体-受体相互作用系统更易设计。该系统有潜力应用于智能的药物递送,细胞计算系统的构建等方面。
陈坤[7]（2020）在《基于CRISPR/dCas9荧光信号放大系统的乳腺癌HER2 mRNA原位杂交检测方法的研究》文中研究说明RNA原位杂交不仅可以帮我们观察细胞中转录本的三维空间结构、探索不同RNA的转录机制和分布规律、还可用于感染性疾病和肿瘤的临床诊断和疗效监测,甚至是“金标准”。目前常用的RNA原位核酸显影可以分为明场可见光条件下的化学发光显色和荧光显色,也就是RNA原位杂交（RNA in situ hybridization,RNA ISH）和RNA荧光原位杂交。但前者通常使用的酶化学反应会导致显影物质在生成后扩散沉积,导致核酸定位弥散且不准确。后者虽然定位准确且分辨率高,但需要特制荧光探针、价格昂贵,杂交过程复杂,费时费力。直到2012年美国加州大学伯克利分校杜德娜教授首次报道CRISPR/Cas9的基因靶向编辑功能后,其原位显影检测方面的应用也得到了逐渐开发,显示出较大的应用潜力。当前基于CRISPR的基因组标记主要依赖于使荧光标记的dCas9蛋白和单链引导RNA（single guide RNA,sgRNA）形成二元复合物,利用该复合物sgRNA上的spacer序列识别并特异性结合靶序列从而使其显影。RNA标记则在此基础上引入一条 2’-OMe 修饰的外源寡核苷酸链（PAM-presenting oligonucleotides,PAMmer）,使其代替PAM引导dCas9/sgRNA复合物识别RNA靶序列从而实现特定RNA分子的荧光标记。这种策略简便、快速且特异性好,正好弥补了当前RNAFISH方法的不足。但该CRISPR/dCas9原位杂交方法的信号往往较弱,只能用于高丰度转录本的显影且无法适用于固定细胞,因此无法满足临床样本检测的需求。因此,为了解决上述现有CRISPR介导RNA原位标记方法所存在的问题使其更具临床转化应用价值,本研究将体外转录包含多个MS2寡核苷酸适配子的sgRNA与纯化得到的dCas9和荧光标记的MS2衣壳蛋白（MS2 coat protein,MCP）连同PAMmer序列在体外组装成复合探针共同孵育固定组织和细胞,成功研发了一种CRISPR介导的能够用于固定组织细胞且方便易用、灵敏高效的单分子RNA原位标记方法:RCasFISH,以满足RNA胞内定位的临床诊断需求。目前用于评价乳腺癌HER2的检测手段主要包括DNA FISH和免疫组织化学技术。FISH的实验过程需要变性,不仅操作繁琐耗时、价格昂贵且有约5%的样本无法最终定性;免疫组织化学对抗体的亲和力要求较高、需要有经验的医师进行判读且结果判断较为主观。临床乳腺癌HER2的判定需要一种简便快速、灵敏准确、经济客观的检测手段。由于绝大多数乳腺癌样本HER2mRNA的与DNA的扩增水平呈正相关,因此可以使用mRNA水平进行HER2状态的辅助判断。在本研究中,我们首先在体外表达纯化了 dCas9和MCP融合蛋白,转录了用于信号放大的3’末端含有多个MS2串联重复序列的sgRNA,最终合成靶向HER2 mRNA所需RCasFISH显影系统的各个组分,之后将其用于不同乳腺癌细胞系HER2mRNA的原位显影。为了评价该系统的检测性能,我们对RCasFISH的标记效率、定量能力、信噪比、灵敏度、特异性、精密度、假阳性率进行了验证并与单分子RNA原位杂交smFISH和RNAscope进行了方法学对比。随后本研究分别对小鼠异体移植瘤和乳腺癌患者福尔马林固定石蜡包埋样本中的HER2 mRNA进行原位定量检测以验证RCasFISH的临床适用性。结果显示,RCasFISH能够有效标记固定组织和细胞中的HER2mRNA及拷贝数在10以下的低丰度RNA转录本。该显影系统对两个及以上碱基突变敏感,标记效率>85%,实验结果拥有良好的信噪比和重复性,批内变异系数小于6.1%。除此之外,RCasFISH可以对细胞内包括低丰度mRNA在内的转录本水平进行单分子定量,计量结果与qRT-PCR结果相近且呈线性相关（r=0.9259）。相比smFISH和RNAscope这两种被广泛使用的单分子RNA原位杂交手段,RCasFISH显示出较高的信噪比和简易省时的特点。此外,在包括43例阳性、37例阴性、2例无法判定HER2状态的共计82例临床乳腺癌队列样本中,RCasFISH的诊断结果与FISH和免疫组织化学结果的一致率为94.5%,检测灵敏度为93.5%,特异性为95.8%,阳性预测值为96.7%,阴性预测值为92.0%,显示出较好的检验效能。值得注意的是,RCasFISH能够对FISH和免疫组织化学定义的“HER2状态无法判定”的乳腺癌样本进行辅助诊断,具有重要的临床分子诊断价值。综上所述,本研究首次成功研发了一种基于CRISPR信号放大系统的单分子RNA原位成像工具。与其他现有的RNA原位检测方法相比,该系统具有简便易用、成本低廉、灵敏高效的特点。关键的是,该系统可以实现固定细胞和组织RNA转录本的定位检测和定量分析,能够辅助临床进行FISH无法判定样本的快速核酸诊断,为传统的RNA原位杂交方法或免疫组化提供了一种切实可行的替代方案,也为其他领域如基因组融合基因转录本及非编码RNA的原位检测转化应用提供了全新的思路和方法。
温小姿[8]（2020）在《多通道实时荧光PCR熔解曲线分析技术快速鉴定临床常见侵袭性真菌》文中研究说明目的:建立多通道实时荧光PCR熔解曲线分析技术（Melting curve analysis,MCA）快速鉴定临床常见侵袭性真菌。方法:1.设计筛选真菌内转录间隔区（Internal transcribed spacer regions,ITS）通用引物和8种TaqMan探针,优化PCR反应体系及条件,检测真菌菌株及临床常见非真菌病原菌分离株,探讨MCA技术的灵敏度、特异性。2.收集合格痰液样本,对比分析MCA技术与真菌培养方法的真菌检出率,评估MCA技术在侵袭性肺部真菌感染（Invasive pulmoary fungal infections,IPFI）的临床应用价值。对比3种痰液样本液化方法,探讨不同液化方法对MCA技术真菌检出率的影响。3.配置不同浓度的6种临床分离念珠菌菌悬液,制作模拟念珠菌血症样本,通过MCA技术检测鉴定,评估MCA技术在侵袭性念珠菌血症（Invasive candidemia,IC）的临床应用价值。结果:1.白色念珠菌的最低检出浓度和解链温度（Melting temperature,Tm）为0.05pg/μL和66.50℃;光滑念珠菌为0.1pg/μL,66.25℃;热带念珠菌为0.1pg/μL,60.15℃;克柔念珠菌为0.1pg/μL,72.15℃;近平滑念珠为0.2pg/μL,63.10℃;季也蒙念珠菌为0.1pg/μL,61.84℃;新型隐球菌为 0.1pg/μL,65.5℃;黄霉菌为 0.05pg/μL,71.50℃;土曲霉、黑曲霉和烟曲霉为0.05pg/μL,76.80℃。13种临床常见非真菌病原菌如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌等熔解曲线分析结果均为阴性。2.164例痰液样本中,MCA技术真菌总检出率为58.5%,白色念珠菌为30.5%,非白色念珠菌为7.8%,曲霉菌为3.7%,混合真菌为16.5%。真菌培养方法真菌总检出率为20.7%,白色念珠菌为17.7%,非白色念珠菌为1.2%,曲霉菌为1.2%,混合真菌为0.6%。59例痰液样本中,4%NaOH液化组真菌总检出率为50.8%,0.1%DTT组为66.1%,1%胰蛋白酶组为62.7%。3.模拟念珠菌血症样本中,模拟白色念珠菌血症样本最低检出浓度为44cfu/mL,光滑念珠菌为73cfu/mL,热带念珠菌为29cfu/mL,近平滑念珠菌为21cfu/mL,克柔念珠菌为71cfu/mL,季也蒙念珠菌为53cfu/mL。结论:1.建立的MCA技术对检测临床常见侵袭性真菌有较高的灵敏度和特异性,可同时检测念珠菌、新型隐球菌、曲霉菌,并能将念珠菌鉴定至种的水平,且与常见的13种非真菌病原菌如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌等不发生交叉反应。2.与真菌培养方法相比,MCA技术检测IPFI痰液样本的真菌具有较高的敏感性,方法更为快捷（约3～4h）、方便,可实现对真菌种属的早期鉴定,对非白色念珠菌、混合真菌感染的检测鉴定具有一定的优势,可为IPFI的临床用药治疗方案提供一定的参考依据。0.1%DTT液化方法与1%胰蛋白酶及4%NaOH相比,对提高MCA技术检测真菌的敏感性具有一定的意义。3.MCA技术检测模拟IC样本具有较高灵敏度,其最低检出浓度可达20-80cfu/mL,并可在4～5 h内得出鉴定结果,具有快速,准确且灵敏度高等特点。可为IC的早期诊断及用药治疗提供一定的参考依据。
张贝贝[9]（2018）在《基于滚环扩增和CRISPR辅助PCR的核酸检测新技术研究》文中指出本研究一共探讨了四种检测核酸的新技术,其中包含两种滚环扩增检测方法和两种PCR检测方法。结合滚环扩增和近红外荧光等技术,开发了两种滚环扩增检测技术。将CRISPR基因编辑应用到PCR技术中,从而发展了两种CRISPR辅助PCR检测技术。1.NM-NIRF-spRCA核酸检测技术通过静电吸附和紫外交联,带正电荷的尼龙膜（Nylon membrane,NM）可以简单方便地固定核酸分子。因此,它是一种常用于核酸检测的固相载体。滚环扩增（Rolling circle amplification,RCA）是广泛用于核酸检测的等温DNA扩增技术。近红外荧光（Near infrared fluorescence,NIRF）是一种新的荧光技术,具有背景低、信噪比高、灵敏度高等优点。本章将NM、RCA和NIRF等材料及技术相结合,开发了一种在尼龙膜上检测核酸的简单方法,命名为基于近红外荧光的尼龙膜固相滚环扩增技术（NM-NIRF-spRCA）。该方法只需要两种核酸分子:滚环（RC）和3′末端带有RCA引物的靶特异性探针（-PP）。检测程序由四个步骤组成:（ⅰ）通过紫外交联将靶核酸固定在NM上;（ⅱ）RC和NM上固定的靶核酸与特异性探针杂交;（ⅲ）进行含有Biotin-dUTP的RCA扩增;（ⅳ）用NIRF标记的链霉亲和素温育NM并用NIRF成像仪成像。通过检测寡核苷酸、质粒中的各种HPV亚型的L1片段和大肠杆菌基因组DNA,充分验证了该方法。因此该研究为检测核酸分子提供了一种新的简便方法。2.SLP-RCA核酸检测技术本章介绍了一种使用茎环引物（Stem-loop primer,SLP）进行滚环扩增的新技术。该技术能够在固相和液相中通过线性或超分支滚环扩增（SLP-1RCA或SLP-HRCA）检测靶DNA。对于固相检测,SLP-HRCA分四步检测核酸:（ⅰ）将各种捕获探针（Capture probe,CP）共价结合在固相载体上形成CP阵列;（ⅱ）将CP阵列与DNA样品杂交;（ⅲ）用含有SLP1、SLP2和Biotin-dUTP的反应液在CP阵列上进行RCA反应;（ⅳ）将CP阵列成像。在液相中,SLP-HRCA检测核酸只需一步:进行包含DNA样品、SLP1和SLP2的实时RCA反应。液相和固相检测都采用通用的滚环模板、SLP2和特异于靶DNA的SLP1。在液相和固相上通过检测寡核苷酸和六种不同的人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）,初步验证了该技术。还在宫颈癌细胞（HeLa和SiHa）和临床样品中检测到了两种高危型HPV（HPV16和HPV18）,这充分验证了该技术的可行性。本研究为RCA核酸检测提供了新的途径。3.Cas9/sgRNA辅助反向PCR核酸检测技术本章开发了一种基于Cas9核酸酶检测靶DNA的新方法,该方法被命名为CARP（Cas9/sgRNA-assistant reverse PCR）即Cas9/sgRNA辅助反向PCR。该技术可以简单、快捷、特异和灵敏地检测靶DNA。该技术分三步来检测靶DNA:（ⅰ）Cas9与一对特异的sgRNA结合后切割靶DNA;（ⅱ）用DNA连接酶连接切割产物;（ⅲ）用PCR扩增靶DNA。在连接步骤中,Cas9切割的靶DNA可以在分子内连接成环状或在分子间连接成线形DNA。最后用一对反向引物通过PCR扩增连接产物。通过在9种不同人乳头状瘤病毒（HPV）亚型中检测HPV16和HPV18 L1基因验证了该技术。该技术还在两个HPV阳性宫颈癌细胞（HeLa和SiHa）的基因组DNA中检测到了两个高危型HPV（HPV16和HPV18）的L1和E6-E7基因,在HPV阴性宫颈癌细胞C-33a中没有检测到这两个基因。通过这些概念验证,本研究提供了一种新的基于CRISPR的DNA检测和分型的方法。特别是本研究验证的CARP方法已进行了HPV临床检测,成功地检测了一批临床样品。4.CRISPR分型PCR核酸检测技术本章发展了一种利用CRISPR技术检测目标DNA的新方法,即CRISPR或Cas9/sgRNA分型PCR（CRISPR-or Cas9/sgRNA-typing PCR,ctPCR）。该技术检测目标DNA只需一步反应:用荧光定量PCR（qPCR）扩增检测Cas9/sgRNA切割后的DNA样品。直接在qPCR反应程序之前额外加一段恒温孵育时间,使Cas9/sgRNA切割反应合并到qPCR反应中。这样就可以用仅仅2个小时的时间来均相检测目标DNA。在整个检测过程中无需打开检测管,ctPCR的全部检测过程可以通过常用的核酸检测设备（荧光定量PCR仪）在较短的时间内完成。通过检测十种不同的人乳头瘤病毒（HPV）亚型的L1基因验证了该技术。该技术在两种HPV阳性宫颈癌细胞（HeLa和SiHa）中成功地检测了两种高危HPV（HPV16和HPV18）的L1和E6-E7基因,在HPV阴性的宫颈癌细胞中没有检测到HPV的L1和E6-E7基因。最后,通过检测临床样品中的HPV进一步验证了ctPCR方法。因此,本研究提供了一种基于CRISPR的检测和分型DNA的新方法。
罗罡[10]（2018）在《基于dual RNA-seq识别变形假单胞菌与斜带石斑互作中的关键毒力基因》文中研究指明变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）是一种海水和淡水中均有分布的革兰氏阴性菌,该菌在一些重要的经济鱼类中已被频繁地发现并导致了非常高的死亡率。然而,就目前而言,关于变形假单胞菌致病机制的研究尚处于起步阶段,基于动态互作转录组探索变形假单胞菌致病机理的研究还未见报道。本研究以变形假单胞菌及其感染的斜带石斑（Epinephelus coioides）病理模型为研究对象,以期识别出变形假单胞菌对斜带石斑致病的关键毒力基因,从而增进对变形假单胞菌致病机理以及病原菌与宿主互作的认识。本研究主要内容如下:提取出野生型变形假单胞菌注射斜带石斑后不同时间点不同器官或组织中基因组DNA后,利用数字PCR技术检测病原菌在鱼体内各器官或组织中的分布情况。结果显示,变形假单胞菌在斜带石斑体内主要通过血液传播,然后在短时间内引发全身性感染;同时,变形假单胞菌在大部分组织中的载量变化存在感染初期短暂下降、之后逐渐上升并在注射后第4d达到最大值、然后又下降的动态分布规律。在感染期的大部分时间点,脾脏中变形假单胞菌的载量均比其它组织要高（注射后第4d达到200多倍）,该结果表明,变形假单胞菌NZBD9菌株感染斜带石斑的主要靶器官是脾脏,这为本研究中dual RNA-seq技术应用的器官取样提供了良好的导向作用。变形假单胞菌感染的斜带石斑脾脏中RNA被提取出后,对构建的cDNA文库进行dual RNA-seq,之后对所有原始测序数据进行过滤,不同样本中均获得Q20大于97%的高质量测序数据（clean reads）。变形假单胞菌和斜带石斑的clean reads分别被进行差异基因分析后,得到病原菌和宿主差异基因的数量:与纯培养变形假单胞菌相比,该病原菌注射斜带石斑后24、48、72和96h的差异基因数分别为258、10,72、808和894;和未感染斜带石斑相比,被病原菌注射后24、48、72和96h斜带石斑差异基因数分别为66,852、77,771、61,369和73,776。注射后48h筛选到的病原菌和宿主差异基因数均是最多的,且不同感染期病原菌和宿主差异基因的表达水平和数量分布均表现出明显的动态变化。分别对病原菌和宿主差异基因进行加权基因共表达网络分析后,获得的共表达模块被进行KEGG功能富集分析,预测出显着富集的主要毒力相关通路为“细菌分泌系统”和“鞭毛组装”通路,主要免疫相关通路为“补体与凝血级联”、“自然杀伤细胞介导的细胞毒性”和“造血细胞系”通路。为了识别变形假单胞菌感染斜带石斑的关键毒力基因,首先对主要毒力和免疫相关通路中差异基因进行基因调控网络构建,预测出变形假单胞菌“sec分泌系统”和“鞭毛组装”通路对宿主的致病性有更重要的作用。之后通过基因共表达网络分析进一步预测到“sec分泌系统”和“鞭毛组装”通路中关键毒力基因分别为secY和fliN。动态分布实验显示:和表达无意义shRNA的变形假单胞菌菌株相比,宿主不同组织中secY和fliN沉默菌株的载量在注射后大部分时间点是显着减少的。secY和fliN沉默菌株感染实验发现,secY沉默菌株感染的斜带石斑存活率显着高于fliN沉默菌株感染的存活率,表明secY对变形假单胞菌毒力的影响大于fliN。综上所述,脾脏为变形假单胞菌感染斜带石斑的主要靶器官,dual RNA-seq同时检测到变形假单胞菌和宿主脾脏的动态互作转录组变化,进一步的生物信息学分析和活体实验识别出secY为变形假单胞菌对斜带石斑致病的关键毒力基因。
二、荧光标记寡核苷酸探针检测变形链球菌（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、荧光标记寡核苷酸探针检测变形链球菌（论文提纲范文）
（1）基于AuNPs-寡聚核苷酸探针的草甘膦免疫学检测技术研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 草甘膦研究进展 |
| 1.1 草甘膦简介 |
| 1.2 GLYP的残留现状 |
| 1.3 GLYP的毒性及危害 |
| 1.4 国内外GLYP最大残留限量标准 |
| 1.5 GLYP检测方法的研究进展 |
| 1.5.1 色谱法 |
| 1.5.2 毛细管电泳分析法 |
| 1.5.3 光谱法 |
| 1.5.4 电化学检测方法 |
| 1.5.5 FRET荧光分析法 |
| 1.5.6 免疫学分析方法 |
| 第2章 金纳米粒子的特性及在检测中的应用 |
| 2.1 尺寸可调性 |
| 2.2 分散稳定性 |
| 2.3 光电特性 |
| 2.4 荧光特性 |
| 2.4.1 光致发光金纳米团簇 |
| 2.4.2 荧光淬灭剂 |
| 第3章 寡聚核苷酸自组装的DNA纳米结构 |
| 3.1 DNA纳米技术 |
| 3.2 DNA纳米结构自组装策略 |
| 3.2.1 树枝状DNA自组装 |
| 3.2.2 DNA瓦片自组装 |
| 3.2.3 DNA折纸自组装 |
| 3.2.4 DNA砖自组装 |
| 3.3 四面体DNA纳米结构的特点及应用 |
| 3.3.1 四面体DNA纳米结构的特点 |
| 3.3.2 四面体DNA在纳米医学中的应用 |
| 3.3.3 四面体DNA在检测中的应用 |
| 第4章 纳米粒子-寡聚核苷酸探针在生物传感中的应用 |
| 4.1 电化学检测方法 |
| 4.2 纳米耀斑探针介导的荧光检测方法 |
| 4.3 基于纳米材料的条形码检测方法 |
| 4.3.1 银沉积型条形码检测 |
| 4.3.2 PCR扩增型条形码检测 |
| 4.4 AuNPs-寡聚核苷酸探针在免疫学检测中的优势 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 GLYP完全抗原的合成与鉴定 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂与耗材 |
| 1.1.2 主要仪器与设备 |
| 1.1.3 主要溶液配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 阳离子化BSA的制备 |
| 1.2.2 c BSA的纯化及浓缩 |
| 1.2.3 c BSA的鉴定 |
| 1.2.4 GLYP免疫抗原的合成 |
| 1.2.5 GLYP检测抗原的合成 |
| 1.2.6 GLYP免疫抗原的双向琼脂糖凝胶电泳鉴定 |
| 1.2.7 GLYP检测抗原的Native-PAGE鉴定 |
| 1.2.8 GLYP完全抗原的UV-Vis光谱扫描鉴定 |
| 1.2.9 免疫小鼠 |
| 1.2.10 GLYP免疫抗原的鼠免疫血清效价检测 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 c BSA鉴定结果 |
| 1.3.2 GLYP完全抗原琼脂糖电泳和Native-PAGE鉴定结果 |
| 1.3.3 GLYP完全抗原UV-Vis光谱扫描鉴定结果 |
| 1.3.4 GLYP免疫抗原的免疫效果分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 载体蛋白的选择 |
| 1.4.2 完全抗原偶联方法的选择 |
| 1.4.3 UV-Vis吸收光谱鉴定完全抗原 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 GLYP多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂与耗材 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 动物免疫 |
| 2.2.2 兔血清效价检测 |
| 2.2.3 血清的采集与保存 |
| 2.2.4 抗体的纯化 |
| 2.2.5 抗体纯度与浓度鉴定 |
| 2.2.6 抗体的效价测定 |
| 2.2.7 抗体亲和力的测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 兔血清效价 |
| 2.3.2 多克隆抗体的纯度与浓度鉴定 |
| 2.3.3 抗体效价检测结果 |
| 2.3.4 抗体亲和力测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 抗体纯化方法的选择 |
| 2.4.2 抗体亲和力的测定 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 ic-ELISA方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂与耗材 |
| 3.1.2 主要仪器与设备 |
| 3.1.3 主要溶液配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 抗原包被浓度及GLYP抗体作用浓度的选择 |
| 3.2.2 抗原包被条件的选择 |
| 3.2.3 封闭液的选择 |
| 3.2.4 GLYP抗体作用条件的选择 |
| 3.2.5 酶标二抗作用条件的选择 |
| 3.2.6 酶底物作用条件的选择 |
| 3.2.7 标准曲线的建立 |
| 3.2.8 交叉反应率的测定 |
| 3.2.9 样品的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 抗原包被浓度及最适多克隆抗体浓度的确定 |
| 3.3.2 抗原包被条件的确定 |
| 3.3.3 封闭液的确定 |
| 3.3.4 GLYP抗体作用条件的确定 |
| 3.3.5 酶标二抗作用条件的确定 |
| 3.3.6 酶底物作用条件的确定 |
| 3.3.7 优化后的ic-ELISA检测程序 |
| 3.3.8 标准曲线 |
| 3.3.9 交叉反应率测定结果 |
| 3.3.10 精密度和准确度评价 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 基于AuNP-TDNs纳米耀斑探针的间接竞争荧光免疫分析方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂与耗材 |
| 4.1.2 主要仪器与设备 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 AuNPs的制备 |
| 4.2.2 TDNs的组装 |
| 4.2.3 TDNs的鉴定 |
| 4.2.4 AuNP-TDNs纳米耀斑探针的制备 |
| 4.2.5 SG浓度优化 |
| 4.2.6 AuNP-TDNs纳米耀斑探针的表征 |
| 4.2.7 检测条件的优化 |
| 4.2.8 标准曲线的建立 |
| 4.2.9 交叉反应率的测定 |
| 4.2.10 实际样品的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 TDNs的FRET鉴定结果 |
| 4.3.2 TDNs的Native-PAGE鉴定结果 |
| 4.3.3 最适SG浓度优化结果 |
| 4.3.4 AuNPs对TDNs-SG的荧光淬灭效率 |
| 4.3.5 AuNP-TDNs-SG探针的表征结果 |
| 4.3.6 检测条件优化结果 |
| 4.3.7 优化后的检测程序 |
| 4.3.8 标准曲线 |
| 4.3.9 交叉反应率测定结果 |
| 4.3.10 精密度和准确度评价 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 影响纳米耀斑探针的因素 |
| 4.4.2 Stern-Volumer曲线的线性和非线性 |
| 4.4.3 凝胶染色方法的选择 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 基于AuNP-dsDNA纳米耀斑探针的竞争荧光免疫分析方法的建立 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要试剂与耗材 |
| 5.1.2 主要仪器与设备 |
| 5.1.3 主要溶液配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 AuNPs的制备 |
| 5.2.2 AuNP-dsDNA纳米耀斑探针的制备 |
| 5.2.3 AuNP-dsDNA纳米耀斑探针的表征 |
| 5.2.4 检测条件的优化 |
| 5.2.5 标准曲线的建立 |
| 5.2.6 交叉反应率的测定 |
| 5.2.7 实际样品的检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 AuNP-dsDNA探针的表征结果 |
| 5.3.2 检测条件优化结果 |
| 5.3.3 优化后的检测程序 |
| 5.3.4 标准曲线 |
| 5.3.5 交叉反应结果 |
| 5.3.6 精密度和准确度评价 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 凝胶染色方法的选择 |
| 5.4.2 硫醇化DNA对 AuNPs的修饰方法 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 基于双功能化AuNPs的条形码扩增检测方法的建立 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 主要试剂与耗材 |
| 6.1.2 主要仪器与设备 |
| 6.1.3 主要溶液配制 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 AuNPs的制备 |
| 6.2.2 AuNPs探针的制备 |
| 6.2.3 AuNPs探针制备条件的优化 |
| 6.2.4 AuNPs和 AuNP探针的表征 |
| 6.2.5 AuNP-BB-iPCR方法的优化 |
| 6.2.6 检测标准曲线的建立 |
| 6.2.7 交叉反应率的测定 |
| 6.2.8 实际样品的检测 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 AuNPs探针合成的最适抗体标记量 |
| 6.3.2 AuNPs探针合成的最适p H |
| 6.3.3 制备AuNPs探针capture DNA最适标记浓度的优化 |
| 6.3.4 AuNPs和AuNPs探针的TEM表征结果 |
| 6.3.5 AuNPs和AuNPs探针的UV-Vis表征结果 |
| 6.3.6 AuNPs探针上抗体标记量的确定 |
| 6.3.7 AuNPs探针上signal DNA标记量的确定 |
| 6.3.8 最适封闭剂 |
| 6.3.9 包被抗原和探针的最适浓度 |
| 6.3.10 优化后的AuNP-BB-iPCR检测程序 |
| 6.3.11 标准曲线 |
| 6.3.12 交叉反应结果 |
| 6.3.13 精密度和准确度评价 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 DNA序列的设计和探针制备条件的选择 |
| 6.4.2 Signal DNA扩增方式的选择 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（2）DNA/Hemin模拟酶催化性能研究及其生物分析应用（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一部分 绪论 |
| 1 脱氧核酶 |
| 2 过氧化物酶模拟DNA酶 |
| 3 DNA/Hemin酶的活性调节 |
| 4 本论文研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二部分 DNA-Hemin酶与传统G4/Hemin酶荧光催化性能对比分析 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 3.结果和讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 动态DNA自组装激活的DNA-Hemin酶系统的荧光生物传感应用 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 3 结果与讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 拉链式组装的高效DNA酶催化性能研究和生物分析应用 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 3 结果与讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 生物医学应用中纳米酶的精准设计 |
| 1 引言 |
| 2.纳米酶的化学设计 |
| 3.纳米酶的生物医学应用 |
| 4 结论及未来展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 读博士期间发表的论文和参加的课题 |
（3）尿路感染病原菌分布和耐药性分析及PCR-量子点荧光技术在尿路感染病原菌鉴定中的应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 4086株尿路感染病原菌分布和耐药性分析 |
| (一)前言 |
| (二)材料与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 试剂与仪器 |
| 3 研究方法 |
| 4 统计学分析 |
| (三)结果 |
| 1 病原菌的分布 |
| 2 尿液培养病原菌的耐药情况 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| 第二部分 PCR-量子点荧光技术在尿路感染病原菌鉴定中的应用 |
| (一)前言 |
| (二)材料与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 试剂与仪器 |
| 3 研究方法 |
| 4 统计学分析 |
| (三)结果 |
| 1 一般资料 |
| 2 PCR量子点荧光法与尿培养结果比较分析 |
| 3 PCR量子点荧光法与质谱结果比较分析 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| 参考文献 |
| 综述 尿路感染生物标志物和检测技术研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（4）基于荧光共振能量转移的食源性致病菌检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 致病菌检测方法 |
| 1.1.1 传统微生物检测方法 |
| 1.1.2 仪器检测方法 |
| 1.1.3 免疫学检测方法 |
| 1.1.4 分子生物学检测方法 |
| 1.1.5 生物传感器检测方法 |
| 1.2 荧光共振能量转移转移技术 |
| 1.2.1 原理 |
| 1.2.2 FRET新型标记材料 |
| 1.2.3 FRET在致病菌分析检测中的应用 |
| 1.3 论文研究的目的意义和主要内容 |
| 第2章 基于Con A-AuNPs和 Aptamer-QDs的双重识别构建FRET传感器检测大肠杆菌 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 仪器与试剂 |
| 2.2.2 Con A-AuNPs的制备 |
| 2.2.3 细菌培养和计数 |
| 2.2.4 Aptamer-QDs的制备 |
| 2.2.5 Aptamer与 QDs琼脂糖凝胶电泳验证 |
| 2.2.6 FRET传感器检测E.coli |
| 2.2.7 FRET传感器检测E.coli的标曲的建立 |
| 2.2.8 FRET传感器检测E.coli的选择性实验 |
| 2.2.9 真实样本检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 Con A-AuNPs合成与表征 |
| 2.3.2 Aptamer-QDs的合成和表征 |
| 2.3.3 基于FRET策略检测E.coli的工作构思和可行性验证 |
| 2.3.4 FRET传感器检测E.coli条件优化 |
| 2.3.5 FRET传感器定量检测E.coli |
| 2.3.6 FRET传感器检测E.coli的选择性实验 |
| 2.3.7 FRET传感器检测真实样本中的E.coli |
| 2.3.8 FRET传感器检测E.coli与其他方法比较 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 基于Teico-AuNPs和 Aptamer-QDs双重识别构建FRET传感器检测细胞内金黄色葡萄球菌 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试剂和药品 |
| 3.2.2 Teico-AuNPs的制备 |
| 3.2.3 Aptamer-QDs的制备 |
| 3.2.4 Citrate-AuNPs的制备 |
| 3.2.5 细菌的培养和计数 |
| 3.2.6 细胞的培养和计数 |
| 3.2.7 细菌感染细胞模型构建 |
| 3.2.8 FRET传感器检测缓冲溶液中S.aureus |
| 3.2.9 FRET探针细胞毒性实验 |
| 3.2.10 FRET传感器检测细胞中S.aureus |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 FRET探针的合成与表征 |
| 3.3.2 FRET传感器检测缓冲溶液中S.aureus的可行性实验 |
| 3.3.3 FRET探针的细胞毒性考察 |
| 3.3.4 S.aureus侵染细胞模型构建 |
| 3.3.5 FRET传感器检测细胞内S.aureus的可行性验证 |
| 3.3.6 细胞内细菌检测条件优化 |
| 3.3.7 检测不同侵染程度的细胞内的细菌 |
| 3.3.8 FRET策略检测细胞内S.aureus与其他方法比较 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 结论和展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.1.1 论文创新点 |
| 4.1.2 论文不足之处 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生期间发表论文 |
（5）基于核酸适配体和纳米材料的鲍曼不动杆菌检测新方法研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1 病原微生物的生物传感技术 |
| 2 病原微生物的生物识别元件 |
| 3 核酸适配体在生物传感器中的应用 |
| 4 纳米材料在生物传感器中的应用 |
| 5 生物传感器的信号转换与处理技术 |
| 6 本研究的目的和主要内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 Zr-MOF的信号放大机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于Zr-MOF的荧光适体传感器用于检测鲍曼不动杆菌 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 基于CRISPR-Cas12a的荧光适体传感器用于检测鲍曼不动杆菌 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文和主持或参与的科研课题 |
（6）脂质-DNA复合结构的细胞应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 脂质和DNA |
| 1.1.1 脂质纳米结构 |
| 1.1.2 DNA纳米结构 |
| 1.1.3 脂质-DNA复合结构 |
| 1.2 脂质-DNA复合结构的应用 |
| 1.2.1 脂质-DNA复合结构的合成 |
| 1.2.2 脂质-DNA复合结构调控细胞相互作用 |
| 1.2.3 脂质-DNA复合结构构建膜孔复合物 |
| 1.2.4 脂质-DNA复合结构分析细胞膜组分的动态变化 |
| 1.2.5 脂质-DNA复合结构重塑细胞膜的形貌 |
| 1.2.6 脂质-DNA复合结构研究细胞膜机械力 |
| 1.2.7 脂质-DNA复合结构研究药物递送 |
| 1.2.8 脂质-DNA复合结构所面临的挑战 |
| 1.3 本课题的设计 |
| 第2章 基于细胞膜上DNA编码的受体-配体相互作用的细胞分类 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂和仪器 |
| 2.2.2 ADR锚定细胞膜 |
| 2.2.3 制备TDFs |
| 2.2.4 配体-受体相互作用 |
| 2.2.5 细胞成像 |
| 2.2.6 流式细胞仪检测 |
| 2.2.7 模式分析的细胞图像 |
| 2.3 结果和讨论 |
| 2.3.1 ADR阳性细胞的制备 |
| 2.3.2 ADR与TDF配体结合 |
| 2.3.3 ADR与TDF配体的相互作用具有正交性 |
| 2.3.4 ADR的重分布途径 |
| 2.3.5 不同细胞ADR与TDF配体的分布模式不同 |
| 2.3.6 基于受体-配体分布模式的细胞分类 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 基于DNA编码的受体-配体相互作用的TDF的细胞定量递送 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂和仪器 |
| 3.2.2 ADR锚定细胞膜 |
| 3.2.3 制备TDFs |
| 3.2.4 配体-受体相互作用 |
| 3.2.5 细胞成像 |
| 3.2.6 流式细胞仪检测 |
| 3.3 结果和讨论 |
| 3.3.1 ADR能提高TDF配体的细胞内化效率 |
| 3.3.2 聚肌苷对内化作用的影响 |
| 3.3.3 ADR介导的TDF配体与细胞的相互作用 |
| 3.3.4 基于多价配体的加权运算 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 基于细胞膜上DNA编码的细胞计算 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验试剂和仪器 |
| 4.2.2 ADR修饰细胞膜 |
| 4.2.3 配体TDF的制备 |
| 4.2.4 制备Dox@TDF |
| 4.2.5 流式细胞仪检测 |
| 4.2.6 MTT测量细胞活性 |
| 4.3 结果和讨论 |
| 4.3.1 “与”逻辑门的构建 |
| 4.3.2 “或”逻辑门的构建 |
| 4.3.3 细胞计算依赖的药物递送 |
| 4.4 结论 |
| 第5章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（7）基于CRISPR/dCas9荧光信号放大系统的乳腺癌HER2 mRNA原位杂交检测方法的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 实验材料和试剂 |
| 1.1.1 实验仪器 |
| 1.1.2 主要实验耗材 |
| 1.1.3 主要实验试剂 |
| 1.1.4 细菌、细胞培养基和各类溶液的配置 |
| 1.1.5 细胞系 |
| 1.1.6 菌株和载体 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 正常对照细胞系、乳腺癌细胞系和EBV转化细胞系的培养 |
| 1.2.2 重组dCas9质粒转化Top10 E.coli.感受态细胞及质粒验证 |
| 1.2.3 dCas9-Halo和MCP-Halo蛋白的表达和纯化 |
| 1.2.4 dCas9-Halo和MCP-Halo融合蛋白的鉴定 |
| 1.2.5 dCas9-Halo和MCP-Halo融合蛋白的定量 |
| 1.2.6 dCas9-Halo和MCP-Halo融合蛋白荧光标记及标记后浓度测定 |
| 1.2.7 体外sgRNA的制备 |
| 1.2.8 PAMmer序列的合成 |
| 1.2.9 细胞爬片准备及细胞预处理 |
| 1.2.10 RCasFISH原位标记细胞RNA |
| 1.2.11 小鼠异种移植乳腺癌细胞系FFPE组织样本的制备 |
| 1.2.12 乳腺癌患者FFPE组织样本的收集和整理 |
| 1.2.13 Stellaris RNA FISH检测HER2 mRNA |
| 1.2.14 RNAscope检测 HER2 mRNA |
| 1.2.15 免疫组织化学检测HER2蛋白 |
| 1.2.16 乳腺癌患者FFPE样本的HER2 DNA FISH |
| 1.2.17 RCasFISH原位标记FFPE组织中的RNA |
| 1.2.18 EMSA实验 |
| 1.2.19 显微镜图像采集和分析 |
| 1.2.20 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 重组pC013-MCP-Halo质粒的鉴定 |
| 2.2 pC013-MCP-Halo质粒转化BL21(DE3)E.coli的PCR鉴定 |
| 2.3 MCP-Halo蛋白的鉴定 |
| 2.3.1 SDS-PAGE电泳鉴定MCP-Halo蛋白 |
| 2.3.2 dCas9-Halo和MCP-Halo蛋白浓度的测定 |
| 2.4 sgRNA的体外转录合成 |
| 2.4.1 sgRNA骨架序列的合成和靶序列的设计 |
| 2.4.2 PCR扩增sgRNA转录模板 |
| 2.4.3 sgRNA的转录和纯化 |
| 2.5 MCP蛋白与sgRNA-MS2结合能力的验证 |
| 2.6 CRISPR/dCas9原位标记系统在固定细胞中标记mRNA |
| 2.6.1 单一sgRNA标记固定细胞HER2 mRNA |
| 2.6.2 RCasFISH标记不同阳性固定细胞系HER2 mRNA |
| 2.7 RCasFISH RNA原位标记系统的性能验证 |
| 2.7.1 RCasFISH各组分对成像的作用 |
| 2.7.2 RCasFISH的定量能力验证 |
| 2.7.3 RCasFISH与smFISH的共定位标记 |
| 2.7.4 RCasFISH的特异性验证 |
| 2.7.5 RCasFISH的灵敏度验证 |
| 2.7.6 RCasFISH检测低丰度转录本 |
| 2.7.7 RCasFISH与RNAscope方法的对比 |
| 2.8 RCasFISH原位标记系统在小鼠异体移植FFPE样本中标记mRNA |
| 2.9 RCasFISH原位标记系统在小鼠异体移植FFPE样本中的检测精密度验证 |
| 2.10 RCasFISH原位标记系统在乳腺癌临床样本中的应用 |
| 2.10.1 RCasFISH原位标记系统在乳腺癌患者FFPE样本中标记mRRNA |
| 2.10.2 RCasFISH原位标记系统与参考检测方法的一致性对比 |
| 2.10.3 RCasFISH原位标记系统在乳腺癌HER2判定中的潜在临床诊断价值 |
| 2.11 RCasFISH与其他HER2检测方法的对比 |
| 2.12 RCasFISH检测EBV转化细胞系胞核中的EBER |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 论文综述 CRISPR/Cas技术在胞内原位核酸成像中的原理及应用 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 pET302-6His-dCas9-Halo载体详细信息 |
| 1. pET302-6His-dCas9-Halo载体结构 |
| 2. pET302-6His-dCas9-Halo载体位点 |
| 3. pET302-6His-dCas9-Halo载体序列 |
| 附录2 pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a载体详细信息 |
| 1. pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a载体结构 |
| 2. pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a载体位点 |
| 3. pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a载体序列 |
| 附录3 生物合成MCP-Halo序列信息 |
| 附录4 pC013-MCP-Halo载体测序和比对结果 |
| 附录5 本研究中用到的sgRNA-MS2骨架序列 |
| 1. 传统sgRNA的骨架序列 |
| 2. sgRNA 2×MS2骨架序列(下划线部分为MS2结构) |
| 3. sgRNA 4×MS2骨架序列(下划线部分为MS2结构) |
| 4. sgRNA 8×MS2骨架序列(下划线部分为MS2结构) |
| 5. sgRNA 16×MS2骨架序列(下划线部分为MS2结构) |
| 附录6 本研究用到的引物序列 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）多通道实时荧光PCR熔解曲线分析技术快速鉴定临床常见侵袭性真菌（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 荧光PCR熔解曲线检测体系的建立与优化 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 菌株来源 |
| 2. 主要试剂 |
| 3. 主要仪器 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 菌株培养 |
| 2. DNA提取 |
| 3. 引物及探针的设计及合成 |
| 4. PCR反应体系及条件的优化 |
| 5. 熔解曲线分析 |
| 6. 灵敏度检测 |
| 7. 特异性检测 |
| 二、结果 |
| (一) 引物特异性分析及TM值 |
| (二) 灵敏度 |
| (三) 特异性 |
| 三、分析与讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 荧光PCR熔解曲线技术在检测侵袭肺部真菌感染呼吸道样本中的应用研究 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 痰液样本 |
| 2. 主要试剂 |
| 3. 主要仪器 |
| (二) 实验方法 |
| 1. MCA技术与真菌培养方法的比较 |
| 2. 不同液化方法对MCA技术检测结果的影响 |
| 二、结果 |
| (一) MCA技术与真菌培养方法的真菌检出率 |
| (二) 不同液化方法的MCA技术真菌检出率 |
| 三、分析与讨论 |
| 四、小结 |
| 第三部分 荧光PCR熔解曲线技术在检测侵袭性念珠菌血症血液样本中的应用研究 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 菌株来源 |
| 2. 血液样本 |
| 3. 主要试剂 |
| 4. 主要仪器 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 菌株准备 |
| 2. 念珠菌血症样本的模拟 |
| 3. DNA提取 |
| 4. 熔解曲线分析 |
| 二、结果 |
| (一) 稀释涂布法的计数 |
| (二) 模拟念珠菌血症 |
| 三、分析与讨论 |
| 四、小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 文献综述 侵袭性真菌感染实验室诊断方法的研究进展 |
| 参考文献 |
（9）基于滚环扩增和CRISPR辅助PCR的核酸检测新技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 滚环扩增技术 |
| 1.1.1 滚环扩增技术的原理 |
| 1.1.2 滚环扩增技术的分类 |
| 1.1.3 滚环扩增技术的优缺点 |
| 1.1.4 滚环扩增技术的应用 |
| 1.2 近红外荧光技术 |
| 1.3 PCR扩增技术 |
| 1.4 基因编辑技术 |
| 1.4.1 基因组编辑核酸酶 |
| 1.4.2 CRISPR-Cas9 |
| 1.4.3 CRISPR核酸检测技术 |
| 1.5 本文主要研究内容 |
| 第二章 NM-NIRF-sp RCA核酸检测技术 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 制备探针和滚环 |
| 2.2.2 制备HPV L1质粒DNA |
| 2.2.3 制备大肠杆菌DH5α 和BL21基因组DNA |
| 2.2.4 靶DNA在尼龙膜上的固定 |
| 2.2.5 用固相RCA检测核酸分子 |
| 2.3 结果和讨论 |
| 2.3.1 NM-NIRF-sp RCA实验方法示意 |
| 2.3.2 滚环制备及质量检测 |
| 2.3.3 尼龙膜近红外固相RCA系统的构建 |
| 2.3.4 检测质粒中的多种HPV亚型 |
| 2.3.5 定量检测HPV质粒DNA |
| 2.3.6 检测DH5α 基因组DNA |
| 2.4 结论 |
| 第三章 SLP-RCA核酸检测技术 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 茎环和滚环的制备 |
| 3.2.2 捕获探针阵列的制备 |
| 3.2.3 lpSLP-HRCA检测寡核苷酸 |
| 3.2.4 spSLP-HRCA检测寡核苷酸 |
| 3.2.5 spSLP-HRCA检测HPV质粒DNA |
| 3.2.6 lpSLP-HRCA检测HPV质粒DNA |
| 3.2.7 lpSLP-HRCA在宫颈癌细胞中检测HPV DNA |
| 3.2.8 mbSLP-HRCA检测HPV DNA |
| 3.2.9 热变性处理lpSLP-HRCA产物 |
| 3.2.10 mbSLP-HRCA检测HPV临床样品 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 SLP-HRCA检测方法示意 |
| 3.3.2 lpSLP-HRCA检测合成的寡核苷酸 |
| 3.3.3 spSLP-HRCA检测合成的寡核苷酸 |
| 3.3.4 spSLP-HRCA检测HPV质粒DNA |
| 3.3.5 lpSLP-HRCA检测HPV质粒DNA |
| 3.3.6 mbSLP-HRCA检测HPV DNA |
| 3.3.7 热变性处理lpSLP-HRCA产物 |
| 3.3.8 mbSLP-HRCA检测HPV临床样品 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 Cas9/sgRNA辅助反向PCR核酸检测技术 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 制备sgRNA |
| 4.2.2 制备HPV L1基因片段 |
| 4.2.3 Cas9/sgRNA切割HPV 16 and 18 L1基因 |
| 4.2.4 CARP检测HPV16和HPV18 L1基因 |
| 4.2.5 CARP检测HPV16 L1基因的灵敏度 |
| 4.2.6 CARP在9个HPV亚型中检测HPV16或 18 L1基因 |
| 4.2.7 CARP检测宫颈癌细胞中HPV L1和E6-E7基因 |
| 4.2.8 CARP检测临床样品中的HPV L1基因 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 CARP检测方法示意 |
| 4.3.2 Cas9/sgRNA切割HPV 16 和 18 L1基因 |
| 4.3.3 CARP检测HPV16和18的L1基因 |
| 4.3.4 CARP检测HPV16和 18 L1基因的灵敏度 |
| 4.3.5 CARP检测9个HPV亚型中的HPV16或 18 L1基因 |
| 4.3.6 CARP检测宫颈癌细胞中的HPV L1和E6-E7基因 |
| 4.3.7 CARP检测临床样品中的HPV L1基因 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 CRISPR分型PCR(ctPCR)核酸检测技术 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 sgRNA的制备 |
| 5.2.2 Cas9/sgRNA切割10种HPV质粒 |
| 5.2.3 ctPCR检测HPV亚型质粒中的L1基因 |
| 5.2.4 ctPCR在宫颈癌细胞中检测HPV L1和E6-E7基因 |
| 5.2.5 ctPCR检测临床样品中的HPV L1基因 |
| 5.2.6 ctPCR检测临床样品中的HPV E6-E7基因 |
| 5.2.7 ctPCR检测临床样品中HPV E6-E7基因的灵敏度 |
| 5.2.8 单酶切ctPCR检测临床样品中的HPV基因 |
| 5.2.9 ctPCR检测的灵敏度 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 ctPCR检测方法示意 |
| 5.3.2 Cas9/sgRNA切割HPV L1基因 |
| 5.3.3 ctPCR检测10种HPV亚型的HPV L1基因 |
| 5.3.4 ctPCR检测He La和Si Ha细胞中HPV18和16基因 |
| 5.3.5 ctPCR检测临床样品中的HPV L1基因 |
| 5.3.6 ctPCR检测临床样品中的HPV E6-E7基因 |
| 5.3.7 ctPCR检测的灵敏度 |
| 5.3.8 单酶切ctPCR检测临床样品中的HPV基因 |
| 5.3.9 ctPCR检测的灵敏度 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 个人履历 |
| 攻读博士学位期间参与的科研项目 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）基于dual RNA-seq识别变形假单胞菌与斜带石斑互作中的关键毒力基因（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 变形假单胞菌研究概况 |
| 1.1.1 变形假单胞菌的生物学特性 |
| 1.1.2 变形假单胞菌流行病学 |
| 1.1.3 变形假单胞菌致病机理的研究现状 |
| 1.2 鱼类免疫系统与免疫应答 |
| 1.2.1 免疫系统 |
| 1.2.2 免疫应答 |
| 1.3 转录组学研究 |
| 1.3.1 转录组和转录组学 |
| 1.3.2 转录组学主要研究技术 |
| 1.3.3 病原菌与宿主相互作用的转录组学研究 |
| 1.4 本研究的目的、内容和创新性 |
| 1.4.1 研究目的与意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 研究的创新性 |
| 第2章 变形假单胞菌在斜带石斑体内的分布 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株和动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌悬液的制备 |
| 2.2.2 人工感染试验 |
| 2.2.3 基因组DNA的提取 |
| 2.2.4 引物探针的设计 |
| 2.2.5 数字PCR反应 |
| 2.2.6 不同组织中变形假单胞菌的检测 |
| 2.2.7 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 斜带石斑存活实验 |
| 2.3.2 病原菌在斜带石斑体内的迁移路径 |
| 2.3.3 病原菌在斜带石斑体内的动态分布 |
| 2.3.4 病原菌感染斜带石斑的主要靶器官 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 变形假单胞菌感染斜带石斑的动态互作转录组分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验菌株和动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 菌悬液的制备和人工感染 |
| 3.2.2 RNA提取和纯化 |
| 3.2.3 cDNA文库的制备和测序 |
| 3.2.4 测序数据的过滤 |
| 3.2.5 序列与病原菌参考基因组比对 |
| 3.2.6 宿主参考转录组的组装和功能注释 |
| 3.2.7 序列与宿主参考转录组比对 |
| 3.2.8 差异基因的识别和Venn分析 |
| 3.2.9 加权基因共表达网络分析 |
| 3.2.10 基因模块的KEGG功能富集分析 |
| 3.2.11 差异基因的q RT-PCR验证 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 测序数据的过滤 |
| 3.3.2 序列与病原菌参考基因组比对结果 |
| 3.3.3 病原菌差异基因的检测结果和Venn分析 |
| 3.3.4 病原菌差异基因加权基因共表达网络分析的结果 |
| 3.3.5 病原菌差异基因的q RT-PCR验证 |
| 3.3.6 参考转录组的组装结果统计和功能注释 |
| 3.3.7 序列与宿主参考转录组比对结果 |
| 3.3.8 宿主差异基因的检测结果和Venn分析 |
| 3.3.9 宿主差异基因加权基因共表达网络分析的结果 |
| 3.3.10 宿主差异基因表达的验证 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 变形假单胞菌感染斜带石斑关键毒力基因的识别 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验菌株和动物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 变形假单胞菌感染斜带石斑关键毒力基因的预测 |
| 4.2.2 变形假单胞菌沉默菌株的构建 |
| 4.2.3 变形假单胞菌生长曲线的测定 |
| 4.2.4 变形假单胞菌毒力测定 |
| 4.2.5 斜带石斑体内变形假单胞菌载量的测定 |
| 4.2.6 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 变形假单胞菌感染斜带石斑关键毒力基因的预测结果 |
| 4.3.2 变形假单胞菌沉默菌株的构建结果 |
| 4.3.3 变形假单胞菌的生长曲线 |
| 4.3.4 变形假单胞菌对斜带石斑的毒性 |
| 4.3.5 变形假单胞菌在斜带石斑体内的动态分布 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 小结与展望 |
| 5.1 小结 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 在学期间发表的学术论文 |
四、荧光标记寡核苷酸探针检测变形链球菌（论文参考文献）
- [1]基于AuNPs-寡聚核苷酸探针的草甘膦免疫学检测技术研究[D]. 关乃瑜. 吉林大学, 2021
- [2]DNA/Hemin模拟酶催化性能研究及其生物分析应用[D]. 李佳. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]尿路感染病原菌分布和耐药性分析及PCR-量子点荧光技术在尿路感染病原菌鉴定中的应用[D]. 李玉武. 大连医科大学, 2021(01)
- [4]基于荧光共振能量转移的食源性致病菌检测方法研究[D]. 张亚青. 西南大学, 2020(01)
- [5]基于核酸适配体和纳米材料的鲍曼不动杆菌检测新方法研究[D]. 杨双双. 重庆医科大学, 2020(01)
- [6]脂质-DNA复合结构的细胞应用[D]. 张露灏. 中国科学院大学(中国科学院上海应用物理研究所), 2020(01)
- [7]基于CRISPR/dCas9荧光信号放大系统的乳腺癌HER2 mRNA原位杂交检测方法的研究[D]. 陈坤. 北京协和医学院, 2020(05)
- [8]多通道实时荧光PCR熔解曲线分析技术快速鉴定临床常见侵袭性真菌[D]. 温小姿. 浙江中医药大学, 2020(02)
- [9]基于滚环扩增和CRISPR辅助PCR的核酸检测新技术研究[D]. 张贝贝. 东南大学, 2018(03)
- [10]基于dual RNA-seq识别变形假单胞菌与斜带石斑互作中的关键毒力基因[D]. 罗罡. 集美大学, 2018(01)
标签：pcr论文; 荧光共振能量转移论文; 磁珠法核酸提取论文; 基因探针论文; 基因合成论文;