核桃外果皮抑制人宫颈癌HeLa细胞活性成分筛选

论文摘要

本文对新疆核桃外果皮抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖的有效部位及活性成分进行筛选。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法从核桃外果皮石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、氯仿萃取部位、正丁醇萃取部位和水萃取部位筛选出对人宫颈癌HeLa细胞生长有抑制作用的有效部位,采用柱色谱法对有效部位中的活性成分进行分离纯化,利用薄层色谱板检识,将分离纯化得到的活性成分通过液-质联用仪（LC-MS）及核磁共振仪（NMR）进行结构鉴定。采用MTT法对活性成分进行人宫颈癌HeLa细胞增殖抑制试验,并通过Hoechst 33342染色法及流式细胞术方法研究其对HeLa细胞凋亡的影响。通过小鼠的最大耐受量试验对活性成分的安全性能进行评价。同时研究了反相高效液相色谱法（RP-HPLC）检测活性成分的条件。结果表明：石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、氯仿萃取部位、正丁醇萃取部位和水萃取部位对人宫颈癌HeLa细胞抑制的IC50值分别为158.81 mg/L,40.43 mg/L,130.49 mg/L,137.67 mg/L,5.10E+07 mg/L。说明核桃外果皮的石汕醚提取物、乙酸乙酯提取物、氯仿提取物、正丁醇提取物对人宫颈癌HeLa细胞均有一定抑制作用,且随着浓度的提高抑制作用增强,其中氯仿提取物的抑制作用最强。采用硅胶柱色谱,洗脱液为氯仿∶乙酸乙酯（3∶7,V/V）,从氯仿提取物中分出的成分,经LC-MS及NMR结构分析,确认为齐墩果酸。采用MTT法检测齐墩果酸对人宫颈癌HeLa细胞的抑制率,齐墩果酸浓度为10-4mol/L时,抑制率达40.22±3.24%；人宫颈癌HeLa细胞经40 mg/L齐墩果酸处理24小时经Hoechst33342染色,在荧光显微镜下可以观察到细胞出现凋亡小体；人宫颈癌HeLa细胞经40 mg/L齐墩果酸处理24小时后经Annexin V-FITC/PI染色后,在流式细胞仪上检测细胞的早期凋亡率为3.93%。对齐墩果酸进行小鼠的最大耐受量试验（MTD）,给药方式采用灌胃。结果表明小鼠在给药7天后心、肝、脾、肺等主要的脏器系数均未发现异常,其对齐墩果酸的最大耐受量大于22.2 mg/kg,相当于体重为60 kg的成人每日用量200 mg的200倍。通过研究建立了核桃外果皮中齐墩果酸含量测定的RP-HPLC法,采用色谱柱为Intersil ODS（150 mm×4.6 mm,5μm）流动相为甲醇∶水∶冰乙酸（265∶35∶0.1,V/V）；流速0.8mL/min进样量20μL；检测波长为210 nm；柱温30℃。结果表明齐墩果酸进样量在0.728～7.28μg（r=0.9997）范围内呈现良好的线性关系,齐墩果酸平均回收率（n-9）为101.1%,相对标准偏差（RSD）为2.44%。测得核桃外果皮中齐墩果酸含量为2.1 mg/100g。该方法简便快速,结果可靠准确,重现性和稳定性好。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 核桃属植物概况
• 1.2 核桃外果皮的研究进展
• 1.3 国内外抗肿瘤植物药的研究进展
• 1.4 宫颈癌的研究进展
• 1.5 核桃属植物中主要活性化学成分的研究概况
• 1.6 植物原料药中有效成分的提取及分离鉴定
• 1.7 齐墩果酸的研究现状
• 1.8 本研究的意义及目的
• 第2章 核桃外果皮抑制人宫颈癌HeLa细胞有效部位的筛选
• 2.1 试剂与仪器
• 2.2 试验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.4 本章小结与讨论
• 第3章 核桃外果皮氯仿萃取部位中活性成分分离纯化及结构鉴定
• 3.1 试剂与仪器
• 3.2 试验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.4 本章小结与讨论
• 第4章 齐墩果酸诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究
• 4.1 试剂及仪器
• 4.2 试验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.4 本章小结与讨论
• 第5章 齐墩果酸的小鼠最大耐受量试验
• 5.1 材料与设备
• 5.2 试验方法
• 5.3 试验结果与分析
• 5.4 本章小结
• 第6章 核桃外果皮中齐墩果酸含量测定方法的建立
• 6.1 试剂与仪器
• 6.2 试验方法
• 6.3 结果与分析
• 6.4 本章小结与讨论
• 第7章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介