利用转基因法创制梨自交亲和性新种质

论文摘要

梨是蔷薇科典型的配子体自交不亲和性果树,生产中必须配置授粉树或人工辅助授粉,否则将影响梨的产量。梨的童期较长,基因组杂合度高,多数性状受多基因遗传控制,使得梨传统改良效率相对较低,很难满足产业现代化需求。随着分子生物学技术发展及对梨基因组学研究的不断深入,利用基因工程直接对目标农艺形状进行定向遗传改良,成为加速梨品种改良的一个重要途径。本研究通过克隆梨的花柱自交不亲和等位基因S3-RNase 和 S34-RNase,并分别构建两个基因的反义表达载体和RNAi载体,拟采用转基因方法沉默梨的S-RNase基因,为创制梨自交亲和性新种质奠定基础。具体研究结果如下：1.以‘丰水’和‘鸭梨’花柱为材料,克隆了S3-RNase 和 S34-RNase基因cDNA全长,并运用双酶切方法和Gateway技术构建了反义表达载体pGSA1285-S3、pGSA1285-S34和RNAi载体pHGRV-S3、pHGRV-S34.2.通过中心组合设计方法,对超声波处理功率、处理时间、间隙时间、处理次数四个因子进行优化；利用表含荧光蛋白基因的表达载体pCAMBIA 1304检测转化效率,建立超声波处理‘黄花梨’花粉介导转化外源基因的技术体系为：超声波处理功率160-170 W、处理时间6-7S、间隙时间7S、处理次数7次。3.利用建立的超声波处理梨花粉介导转化体系处理‘黄花梨’花粉,并以‘丰水’、‘翠冠梨’和‘砀山酥梨’为母本进行杂交授粉,获得杂交种子并培育成苗。通过PCR检测,在‘丰水’ב黄花梨’杂交后代中检测得到了3株pGSA1285-S3反义表达载体转基因植株。4.将pHGRV-S3、pHGRV-S34RNAi质粒转入农杆菌GV3101后,利用农杆菌菌株侵染梨叶片,并得到了‘鸭梨’的再生芽,这为后续开展梨自交亲和性种质创新奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 梨遗传转化研究进展
• 1.1 抗病抗虫性状的遗传转化研究
• 1.2 果实性状的遗传转化研究
• 1.3 其它方面遗传转化研究
• 2 果树的遗传转化方法
• 2.1 农杆菌介导法
• 2.2 基因枪法
• 2.3 超声波处理花粉介导法
• 3 植物自交不亲和性研究进展
• 3.1 孢子体自交不亲和性
• 3.2 配子体自交不亲和性
• 4 梨的自交亲和性与不亲和性分子机制
• 5 反义RNA及RNAi研究进展
• 5.1 反义RNA研究进展
• 5.2 RNAi研究进展
• 6 梨组织培养研究进展
• 6.1 茎尖培养
• 6.2 叶片培养
• 6.3 胚性愈伤的诱导
• 7 本研究目的及意义
• 第二章 超声波处理‘黄花梨’花粉介导法遗传转化体系建立
• 前言
• 1 试验材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 梨花粉等渗溶液的筛选
• 1.3 超声波处理条件的优化
• 1.4 质粒提取
• 1.5 外源基因插入梨花粉的效率检测
• 2 试验结果与分析
• 2.1 花粉等渗溶液的选择
• 2.2 超声波处理条件的优化
• 2.3 含GFP基因pCAMBIA 1304表达载体质粒的检测
• 2.4 以梨花粉为介导的GFP载体转化效率
• 3 讨论
• 第三章 梨S基因克隆及表达载体构建
• 前言
• 第一节 S3-RNase和S34-RNase基因的cDNA全长克隆
• 1.1 试验材料及设备
• 1.2 试验方法
• 1.3 结果与分析
• 第二节 反义表达载体的构建
• 2.1 试验材料及方法
• 2.2 结果与分析
• 第三节 Gateway技术构建RNAi载体
• 3.1 试验材料及方法
• 3.2 结果及分析
• 4 讨论
• 第四章 利用超声波处理花粉介导法创制梨自交亲和性新种质
• 前言
• 1 试验材料及方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果及分析
• 2.1 统计‘黄花梨’花粉的萌发率
• 2.2 杂交授粉组合授粉数量及坐果率
• 2.3 种子发芽率调查
• 2.4 梨杂交苗基因组DNA的提取
• 2.5 PCR验证结果
• 3 讨论
• 第五章 农杆菌介导法转化‘鸭梨’和‘翠冠梨’的初步研究
• 前言
• 1 试验材料及方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果及分析
• 2.1 优化‘鸭梨’和‘翠冠梨’诱导培养基
• 2.2 表达载体转入农杆菌的检测
• 2.3 农杆菌侵染后叶片分化不定芽结果
• 3 讨论
• 全文结论
• 主要创新点
• 参考文献
• 附图
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢