野猪、野家杂交猪及家猪LPL基因表达规律及定量比较研究

论文摘要

脂蛋白脂酶（Lipoprotein Lipase,LPL）是动物组织脂肪沉积的关键酶,它能催化甘油三酯的水解,调节脂肪代谢,亦能同时结合脂蛋白和细胞表面特异蛋白,促进脂蛋白被细胞结合和吸收,在脂质代谢和转运过程中起重要作用。LPL基因也一直被当作是影响脂肪代谢相关性状的重要基因。猪是脂肪沉积型经济动物,野猪与家猪之间脂肪沉积能力、肌内脂肪含量和肉品多不饱合脂肪酸含量差异较大。因此,研究野猪、野家杂交猪和家猪之间LPL的表达差异,将有助于深入了解LPL在脂肪沉积中的调控作用,并为野猪资源利用提供更多依据。本研究采用半定量RT-PCR方法研究了LPL在3、6、9、12月龄大白猪、野家杂交猪和12月龄野猪的心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠、背肌和腿肌等10个组织中mRNA水平上的表达规律;采用竞争性RT-PCR方法检测了3、6、9、12月龄大白猪、野家杂交猪和12月龄野猪背肌中LPL mRNA的表达规律和表达量。主要研究结果如下:1.LPL基因在所检测的大白猪、野家杂交猪和野猪的10个组织中均有表达,且在心肌中表达水平始终较高,在肝和肺中表达水平始终较低。在脾、肾、胃、大肠、小肠和肌肉中LPL的表达存在空间和组织间的特异性。12月龄背肌中LPL基因表达量大白猪最高、野家杂交猪次之,野猪最低。2.LPL基因在心脏各生长发育阶段的表达水平野家杂交猪均高于大白猪;在肝、脾、肾、大肠、背肌和腿肌中的表达规律大白猪与野家杂交猪之间存在着表达曲线类型、表达高峰所处的生长阶段和表达强度上的差异。在大白猪和野家杂交猪背肌生长发育过程中LPL表达曲线类型不同,虽然表达量的变化总体上都呈上升趋势,但大白猪背肌LPL的表达高峰处于12月龄,而野家杂交猪背肌LPL的表达高峰处于6月龄,且在3月龄和6月龄野家杂交猪背肌中LPL mRNA的浓度分别是大白猪的3倍和2倍,比大白猪的大4.98E-4μg/ml和7.88E-4μg/ml;9月龄和12月龄大白猪背肌中LPL mRNA的浓度比野家杂交猪的分别大3.42 E-4μg/ml和1.48E-4μg/ml。野家杂交猪和大白猪的LPL表达差异说明野家杂交猪的发育周期和大白猪不一致,同时量的差异表明大白猪的脂肪沉积程度更高。3.本实验通过构建同源性竞争模板进行竞争性RT-PCR反应定量检测了猪背肌中LPL mRNA的浓度,在3、6、9、12月龄的大白猪背肌中的浓度分别为2.06E-4μg/ml、6.02E-4μg/ml、1.21E-3μg/ml、1.08E-3μg/ml;在3、6、9、12月龄的野家杂交猪背肌中的浓度分别为7.02E-4μg/ml、1.39E-3μg/ml、8.68E-4μg/ml、9.32E-4μg/ml;在12月龄的野猪背肌中的浓度为9.10E-4μg/ml。竞争性RT-PCR实验中所设计的定量检测引物在对LPL mRNA进行定量时仅需33个循环的PCR反应即可计算结果,且所得浓度值精确到pg/ml,竞争性RT-PCR是一种不依赖于实时荧光定量PCR仪的经济、快捷、精确的定量方法。研究中采用半定量RT-PCR法检测的LPL基因在大白猪和野家杂交猪背肌中的表达规律与竞争性RT-PCR法的检测结果基本一致,符合脂肪在肌肉内沉积的规律。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 脂蛋白脂酶的生物学功能
• 1.1.1 LPL 的表达与脂质代谢的关系
• 1.1.2 LPL 在生产育种上的应用
• 1.2 猪的脂肪沉积研究
• 1.2.1 脂肪沉积机理
• 1.2.2 皮下脂肪和肌内脂肪沉积机理
• 1.2.3 野家杂交猪和普通家猪的脂肪含量差异
• 1.3 竞争性RT-PCR
• 1.3.1 竞争性RT-PCR 原理
• 1.3.2 标准曲线的绘制及定量结果的计算
• 1.4 本研究的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要药品、酶及试剂盒
• 2.1.5 菌株和克隆载体
• 2.1.6 主要分子生物学软件
• 2.1.7 相关生物信息学网站
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 样本采集
• 2.2.2 组织样总RNA 的提取与检测
• 2.2.3 引物设计与合成
• 2.2.4 反转录
• 2.2.5 PCR 扩增
• 2.2.6 PCR 产物的克隆测序
• 2.2.7 半定量RT-PCR 分析
• 2.2.8 竞争性RT-PCR
• 3 结果与分析
• 3.1 总RNA 的质量检测
• 3.1.1 总RNA 的浓度和纯度检测
• 3.1.2 总RNA 的完整性检测
• 3.2 半定量RT-PCR 分析猪LPL 基因表达规律
• 3.2.1 LPL 基因目的片段的克隆
• 3.2.2 β-actin 基因的PCR 扩增
• 3.2.3 半定量RT-PCR 反应循环参数的确定
• 3.2.4 大白猪LPL 基因组织表达规律分析
• 3.2.5 野家杂交猪LPL 基因组织表达规律分析
• 3.2.6 野猪LPL 基因组织表达规律分析
• 3.2.7 猪生长发育过程中同一组织不同发育阶段LPL 组织表达规律的比较
• 3.2.8 不同猪种同一发育阶段LPL 基因组织表达规律的比较
• 3.2.9 猪生长发育过程中不同部位肌肉组织LPL 表达规律的比较
• 3.3 竞争性RT-PCR 分析猪LPL 基因表达规律
• 3.3.1 LPL 基因同源性竞争模板的制备
• 3.3.2 LPL 基因同源竞争模板的浓度
• 3.3.3 LPL 基因同源性竞争模板的倍比稀释及检测
• 3.3.4 竞争性RT-PCR 循环参数的确定
• 3.3.5 大白猪肌肉组织LPL 基因的竞争性RT-PCR 分析
• 3.3.6 野家杂交猪肌肉组织LPL 基因的竞争性RT-PCR 分析
• 3.3.7 野猪肌肉组织LPL 基因的竞争性RT-PCR 分析
• 3.3.8 野猪、野家杂交猪和大白猪肌肉组织LPL 表达量的比较
• 3.4 RT-PCR 和QC-PCR 检测猪肌肉组织LPL 基因表达规律的比较
• 3.4.1 RT-PCR 和QC-PCR 检测大白猪肌肉组织LPL 表达规律的比较
• 3.4.2 RT-PCR 和QC-PCR 检测野家杂交猪肌肉组织LPL 表达规律的比较
• 4 讨论
• 4.1 关于总RNA 的提取
• 4.2 关于竞争性RT-PCR
• 4.3 猪LPL 基因的组织表达分析
• 4.3.1 大白猪LPL 基因不同组织和发育阶段的表达规律分析
• 4.3.2 野家杂交猪LPL 基因不同组织和发育阶段的表达规律分析
• 4.3.3 野猪、野家杂交猪和家猪LPL 基因不同组织表达规律比较分析
• 4.4 LPL 在猪肌肉组织表达上的RT-PCR 和QC-PCR 比较分析
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文