聚阳离子非病毒载体的合成、表征与构建

论文摘要

聚阳离子非病毒载体具有性质稳定、无免疫源性、携载基因容量大、结构可灵活修饰以及易于制备等优点,目前正受到越来越多研究者的关注。但是其缺乏靶向机制、体内应用产生累积毒性、转染效率相对病毒载体较低等缺点限制了其在基因输送方面的进一步应用。因此,构建具有高效、低毒特性的可生物降解聚阳离子非病毒载体可能成为基因治疗技术取得突破的关键环节之一。本文主要针对聚阳离子非病毒载体构建等方面的研究,以聚乙烯亚胺（polyethylenimine, PEI）为基础,合成并表征了聚氨酯结构的可降解的PEI衍生物（Poly-Link,PL）,该聚合物因其能够降解成安全的化学小分子以及降解过程中不产生不利于PL/DNA溶酶体逃逸的酸等优势而具有高效、低毒的特性,从而表明这种构建方式能有效地改善聚阳离子非病毒载体基因输送性质,为其作为治疗试剂的应用提供了借鉴。首先回顾了聚阳离子非病毒载体领域的研究现状,指出其应用中存在的问题,并提出本文研究目标和工作重点。在以PEI为基础的聚阳离子非病毒载体的合成方面,以1, 4-丁二醇二氯甲酸酯连接剂交联小分子分支状PEI-800（bPEI,Mw=800）合成聚氨酯结构的PL,凝胶色谱法测得PL分子量为3924（Mw）,在pH=4.5的环境下,降解半衰期约为100天。在PL/DNA复合物的表征方面,复合物质量比>1.0时,PL便能有效地复合DNA,形成稳定的形状规则的球形复合物颗粒,平均粒径低于100nm,表面zeta电势保持在20mv左右。在PL体外转染方面,以PL作为载体,Cos-7细胞为宿主,介导质粒DNA进行转染,结果表明PL/DNA复合物质量比大于7时,体外转染效率就已经高于阳性对照bPEI-25k,且转染效率与质量比成正比。复合物质量比为40时,转染72h可达最佳效果,PL细胞毒性与低毒的bPEI-800相仿,且PL浓度增大细胞毒性未见明显增加。在PL体内转染方面,向小鼠体内尾静脉注射PL/DNA复合物,介导质粒DNA进行转染,结果表明PL体内转染效率较低,且有一定的毒性,但转染效率高于bPEI-25k而毒性更低,静注后复合物被动靶向于肺部。最后对全文的研究工作进行了总结,并指出部分有待于深入研究的问题。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 基因治疗简介
• 1.2 PEI 的理化性质
• 1.3 PEI 的转染机理
• 1.4 基于PEI 的非病毒载体构建
• 1.5 研究思路与实验方案
• 第二章 聚阳离子非病毒载体的合成和表征
• 2.1 材料与仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 聚阳离子非病毒载体的合成
• 2.2.2 傅立叶红外光谱检测
• 2.2.3 核磁共振氢谱检测
• 2.2.4 凝胶色谱法测定聚合物分子量
• 2.2.5 凝胶色谱法测定降解特性
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 聚阳离子非病毒载体的合成
• 2.3.2 傅立叶红外光谱检测
• 2.3.3 核磁共振氢谱检测
• 2.3.4 凝胶色谱法测定聚合物分子量
• 2.3.5 凝胶色谱法测定降解特性
• 第三章 聚阳离子非病毒载体与质粒DNA 复合颗粒表征
• 3.1 材料与仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 PL/DNA 复合物的制备
• 3.2.2 PL/DNA 复合物的凝胶电泳阻滞实验
• 3.2.3 PL/DNA 复合物粒径检测
• 3.2.4 透射电镜观察PL/DNA 复合物形态
• 3.2.5 PL/DNA 复合物表面电荷测定
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 PL/DNA 复合物的凝胶电泳阻滞实验
• 3.3.2 PL/DNA 复合物粒径检测
• 3.3.3 透射电镜观察PL/DNA 复合物形态
• 3.3.4 PL/DNA 复合物表面电荷测定
• 第四章 聚阳离子非病毒载体体外转染效果
• 4.1 材料与仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 细胞培养
• 4.2.2 PL 细胞转染效率测定
• 4.2.3 MTT 法测定PL 细胞毒性
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 PL 细胞转染效率测定
• 4.3.2 MTT 法测定PL 细胞毒性
• 第五章 聚阳离子非病毒载体体内转染效果
• 5.1 材料与仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 DNA/PL 复合物的制备
• 5.2.2 动物实验
• 5.2.3 PL 体内转染活性检测
• 5.3 实验结果与讨论
• 5.3.1 PL 体内静注的毒性情况
• 5.3.2 PL 体内转染活性检测
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文