层层组装构建基因控释超薄膜的研究

论文摘要

本论文以生物医用装置与基因治疗相结合为背景，采用层层静电自组装技术（Electrostatic layer-by-layer（LbL）self-assembly）和基因技术相结合，构建了负载基因DNA分子的纳米超薄膜，探索了该超薄膜作为原位控释基因传递体系的研究。研究首先采用具有良好生物相容性和生物可降解性的聚赖氨酸（PLL）作为模型聚阳离子和DNA层层组装，构建酶敏感降解的PLL/DNA超薄膜。紫外（UV）光谱和原子力显微镜（AFM）数据显示层层自组装可成功进行，形成具有纳米尺度的超薄膜。通过调节组装溶液中的离子强度，可调控吸附聚电解质的质量，从而可在纳米尺度上调控超薄膜的厚度和DNA的负载量。AFM测试、溴乙啶（EtBr）吸附实验数据显示（PLL/DNA）超薄膜组装过程中，PLL和DNA分子可能相互缠结形成复合物（complex），该种复合物可有效保护DNA分子，阻止荧光染料内嵌，为安全有效的传递基因物质提供了前提保证。研究进一步探索了PLL/DNA超薄膜的酶降解特性。UV光谱和AFM数据证明，该种超薄膜在蛋白酶溶液中能够逐步降解，超薄膜中的DNA由此得到持续的释放。进一步的研究表明，通过戊二醛交联超薄膜中的PLL，可简单易行的调控超薄膜在酶溶液中的降解速率，从而达到精确调控DNA释放的目的。研究首次提出并证实蛋白酶降解机制控制超薄膜解组装，特有的酶响应机制使DNA的释放具有生物响应性和可控性，使超薄膜在特种酶响应环境下的基因治疗具有巨大的应用前景。聚阳离子型非病毒基因载体所制备的DNA纳米微球由于具有低成本、高安全性等特质，在介导基因转染领域有着广泛的研究。研究将开展通过LbL技术负载聚阳离子为载体的DNA纳米微球，构建（DNA微球/聚阴离子）型超薄膜。首先，实验制备了稳定的，直径在10—30nm左右，表面电位为31.6±6.09mV的聚阳离子聚乙烯亚胺（poly（ethyleneimine），PEI）为载体的DNA纳米微球。LbL组装过程中，UV光谱和AFM数据表明，DNA微球可以成功吸附到聚谷氨酸（PGA）或聚乙烯苯磺酸钠（PSS）层表面，DNA微球和聚阴离子反复交替的吸附，形成纳米尺度的超薄膜。透射电镜（TEM）显微照片清楚显示了基材表面所构建的超薄膜，平均一个双层的（DNA微球/PGA）和（DNA微球/PSS）超薄膜分别为6和18nm。通过LbL技术温和的组装环境，非常方便的构建出组装有DNA纳米微球的纳米尺度的超薄膜，并且最大程度保持了DNA微球的缔合状态，为该种DNA微球在生物体内的传递提供了强有力的技术平台。研究最后考察了（PLL/DNA）和（DNA微球/聚阴离子）两种类型超薄膜的细胞转染能力。研究首先考察了具有生物酶可降解性的（PLL/DNA）超薄膜。实验结果表明，将超薄膜酶降解，从中释放的DNA分子仍保持有原有的生物活性，可转染细胞。研究接着考察了同样具有生物可降解性的（DNA微球/PGA）超薄膜。实验结果表明，通过蛋白酶的降解，DNA微球可从超薄膜中释放出来，并且该种DNA微球保持了其特有的缔合状态，可直接转染细胞，而无须加入新的帮助转染的载体。进一步的研究表明，（DNA微球/聚阴离子）型超薄膜也可原位转染贴壁于上的细胞。基于PSS的超薄膜表面由于可提供更高密度的DNA微球，因此可以达到比基于PGA的超薄膜更高的原位转染率。通过将（DNA微球/PGA）超薄膜组装在三维聚乳酸组织工程支架上，实现了细胞在组织工程支架表面的转染。对基因超薄膜的细胞转染研究，清楚显示其作为DNA传递体系在基因治疗领域有着切实可行的应用前景。本论文的研究工作成功构建了具有酶敏感特性的（PLL/DNA）超薄膜和高效负载DNA微球的（DNA微球/聚阴离子）超薄膜。两种类型的基因超薄膜可与生物医用装置相结合，在不久的将来，该技术不但有望解决医用装置本身在生物相容性和生物功能化方面所存在的种种不足，同时也将极大的拓展生物医用装置在基因治疗领域中的应用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 生物医用装置
• 1.1.1 生物医用装置定义
• 1.1.2 生物医用装置概况
• 1.1.2.1 人工器官
• 1.1.2.2 组织工程及其支架
• 1.1.2.3 介入治疗及其装置
• 1.1.3 生物医用装置面临的挑战
• 1.1.3.1 生物相容性
• 1.1.3.2 生物功能性
• 1.2 基因治疗
• 1.2.1 基因治疗的定义
• 1.2.2 基因与疾病的密切关系
• 1.2.3 基因治疗的发展
• 1.2.4 基因治疗技术在一些领域中的应用
• 1.2.4.1 基因治疗在肿瘤疾病中的应用
• 1.2.4.2 基因治疗在心血管疾病中的应用
• 1.2.4.3 基因治疗在组织工程中的应用
• 1.2.5 基因传递在基因治疗中的重要意义
• 1.2.5.1 典型基因传递方法
• 1.2.6 基因治疗技术和生物医用装置的结合
• 1.2.6.1 通过生物医用装置传递基因
• 1.3 层层静电自组装（LbL）技术
• 1.3.1 基于静电自沉积作用的LbL超薄膜
• 1.3.2 LbL技术在生物材料领域的应用研究
• 1.3.3 基于LbL技术的DNA超薄膜
• 1.4 课题的提出与研究思路
• 1.4.1 课题提出
• 1.4.2 途径一:LbL技术构建（可降解聚阳离子/DNA）超薄膜
• 1.4.3 途径二:LbL技术构建（非病毒型载体DNA微粒/聚阴离子）超薄膜
• 1.5 参考文献
• 第2章 LBL技术构建（PLL/DNA）超薄膜的研究
• 2.1 （PLL/DNA）超薄膜的组装和表征
• 2.1.1 （PLL/DNA）超薄膜的组装
• 2.1.1.1 材料
• 2.1.1.2 组装步骤
• 2.1.2 （PLL/DNA）超薄膜的表征及分析
• 2.1.2.1 接触角
• 2.1.2.2 紫外光谱（UV）
• 2.1.2.3 原子力显微镜（AFM）
• 2.1.2.4 透射电子显微镜（TEM）
• 2.1.2.5 EtBr吸附表征
• 2.1.3 离子强度对（PLL/DNA）超薄膜组装影响的研究
• 2.1.3.1 实验条件和组装过程
• 2.1.3.2 超薄膜的表征及分析
• 2.2 （PLL/DNA）超薄膜的解组装及DNA的释放
• 2.2.1 离子攻击导致超薄膜的解组装及DNA的释放
• 2.2.1.1 （PLL/DNA）超薄膜在不同离子强度溶液中的解组装
• 2.2.1.2 （PLL/DNA）超薄膜解组装及DNA释放的表征及分析
• 2.2.2 蛋白酶降解聚阳离子导致超薄膜的解组装及DNA的释放
• 2.2.2.1 （PLL/DNA）超薄膜在蛋白酶溶液中的解组装
• 2.2.2.2 （PLL/DNA）超薄膜解组装及DNA释放的表征及分析
• 2.2.3 超薄膜酶解基础上的DNA控制释放的研究
• 2.2.3.1 戊二醛（GA）交联超薄膜精确控制DNA释放速率
• 2.2.3.2 不同种类可降解聚阳离子的超薄膜对DNA释放速率的影响
• 2.3 本章小结
• 2.4 参考文献
• 第3章 LBL技术构建（非病毒型DNA微球/聚阴离子）超薄膜的研究
• 3.1 非病毒型基于聚阳离子为载体DNA纳米微球
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 DNA微球的制备
• 3.1.3 DNA微球的表征及分析
• 3.2 （DNA纳米微球/聚阴离子）超薄膜的组装
• 3.2.1 基于聚谷氨酸（PGA）的超薄膜
• 3.2.1.1 超薄膜的组装
• 3.2.1.2 超薄膜组装的表征及分析
• 3.2.2 基于聚乙烯苯磺酸钠（PSS）的超薄膜
• 3.2.2.1 超薄膜的组装
• 3.2.2.2 超薄膜组装的表征及分析
• 3.3 本章小结
• 3.4 参考文献
• 第4章 超薄膜的细胞转染研究
• 4.1 （PLL/DNA）超薄膜的细胞转染研究
• 4.1.1 （PLL/DNA）超薄膜释放DNA并对细胞的转染
• 4.1.1.1 实验部分
• 4.1.1.2 释放DNA对HEK293T细胞的转染表征及分析
• 4.2 （DNA微球/PGA）超薄膜降解释放DNA微球并对细胞的转染
• 4.2.1 实验部分
• 4.2.2 细胞转染的表征及分析
• 4.3 （DNA微球/聚阴离子）超薄膜的原位细胞转染研究
• 4.3.1 平面超薄膜对细胞的原位转染
• 4.3.1.1 实验部分
• 4.3.1.2 细胞转染的表征及分析
• 4.3.2 三维（3D）组织工程支架表面超薄膜对细胞的转染
• 4.3.2.1 聚乳酸PLA三维（3D）支架的制备
• 4.3.2.2 实验部分
• 4.3.2.3 细胞转染的表征及分析
• 4.4 本章小结
• 4.5 参考文献
• 全文总结
• 全文主要结论
• 特色与创新
• 问题与展望
• 作者简介
• 致谢