水泡性口炎病毒胶体金快速诊断试纸条的研制

论文摘要

水泡性口炎（Vesicular Stomatitis,VS）又名“伪口疮（Pseudoaphthosis）”是由水泡性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus,VSV）引起牛、马、猪、羊等多种动物以及人的一种高度接触性传染病，临床上主要以在感染动物的口腔黏膜、舌、唇、乳头、蹄冠等部位皮肤、黏膜形成水泡为特征。该病自1821年在美国暴发以来，在南美、欧洲、非洲以及我国的新疆吉林等地陆续有该病的报道，其发病很可能呈世界性分布，且随着VSV在许多国家的流行蔓延造成世界肉类市场的混乱，同时给养殖业造成了严重的经济损失。目前，检测VSV的方法主要有病毒的分离鉴定、血清中和试验（VN）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）、半巢式PCR（Semi-nested PCR）、实时荧光定量PCR（Real-TimePCR）等，但这些方法费时费力，需要专业的实验室人员和特殊的仪器设备，既不适合基层工作人员检测时的需要，又不适合该病暴发流行时的检测。因此，研制一种操作简单、使用方便的VSV检测方法对基层人员是十分有必要的。近年来，利用杂交瘤技术制备单克隆抗体（McAb）的方法经过不断的改进已日趋成熟，在现代生命科学的研究中得到了广泛的应用，如疾病的诊断、诊断方法的建立等都与单抗有关。本研究采用蔗糖密度梯度离心法纯化VSV，免疫健康Balb/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0细胞进行融合，用已建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，筛选出2株稳定分泌抗VSV的单抗，分别命名为1A2和4C3。经鉴定，2株单抗效价在1:25600～1:51200之间；亚类鉴定证实2株单抗均为IgG1；经Western blot分析，2株单抗中1A2主要针对VSV-G蛋白；经间接免疫荧光（IFA）和间接ELISA方法鉴定，2株单抗均能与VSV结合，其特异性良好。以上结果表明获得的单抗是制备水泡性口炎病毒胶体金快速诊断试纸条的理想试剂。胶体金免疫层析技术（gold immunochromtographic assay, GICA）是在抗原-抗体反应基础上结合胶体金标记技术和层析分析技术，以胶体金作为示踪物建立的一种新型检测技术，具有操作简单方便、结果判定直观，适于发病现场、门诊以及不具备实验条件的场所。本研究在成功制备VSV单抗的基础上，结合胶体金免疫层析技术建立了检测VSV的胶体金快速诊断试纸法。采用柠檬酸三钠（C6H5O7Na3·2H2O）还原法制备胶体金，电镜下观察金颗粒大小在30nm左右；通过OD值法确定胶体金与单抗1A2结合的最佳pH值为8.5，最佳结合浓度为35μg/mL；用金标单抗包被玻璃纤维膜，分别喷点兔抗VSV多抗、羊抗小鼠IgG于硝酸纤维膜检测线、质控线，组装试纸条。用组装好的试纸条检测不同浓度的VSV，结果最低可检测5μg/mL的病毒，且与FMDV、SVDV、VESV、PRRSV和RABV等病毒无交叉反应。同时，用制备的单抗和多抗建立了检测VSV的双抗体夹心ELISA方法，该方法的敏感性可达3.75μg/mL，标准曲线在3.75μg/mL-500μg/mL范围内线性良好。通过与双抗体夹心ELISA比较，水泡性口炎病毒胶体金快速诊断试纸法具有特异性好、敏感性高、准确度高、重复性好、稳定性高、操作方便等优点，在VSV的早期诊断上具有重要意义。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第1章 水泡性口炎病毒的研究进展
• 1.1 水泡性口炎病毒基因组结构
• 1.2 水泡性口炎病毒结构蛋白及功能区
• 1.3 VSV 的应用
• 1.4 小结
• 第2章 水泡性口炎病毒诊断方法的研究进展
• 2.1 水泡性口炎的流行概况
• 2.2 水泡性口炎诊断的检测技术
• 2.3 水泡性口炎病毒新型疫苗的开发
• 2.4 小结
• 第二篇 研究内容
• 第1章 水泡性口炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 第2章 水泡性口炎病毒胶体金快速诊断试纸条的研制
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第3章 水泡性口炎病毒胶体金快速诊断试纸法与双抗体夹心ELISA 法的比较
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的学术论文
• 导师及个人简介
• 致谢