miRNA-146a在胃癌中的表达及功能研究

论文摘要

目的:研究miRNA-146a （miR-146a）在胃癌组织和细胞系中的表达和功能,并且探索其可能的分子机制。方法:qRT-PCR检测43例胃癌组织和对应癌旁组织miR-146a的表达,分析其表达和临床病理参数和预后的关系;同时,qRT-PCR检测人胃癌细胞株MKN-28,SGC-7901,BGC-823,MKN-45和胃粘膜上皮永生化细胞GES-1的miR-146a表达情况;外源性转染miR-146a使MKN-45细胞中miR-146a表达升高,MTT方法观察其升高后对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测miR-146a表达升高后对MKN-45细胞周期和凋亡的影响,以及对胃癌常用的化疗药物oxaliplatin,docetaxcel敏感性的影响;“scratch wound healing”实验和铺或者不铺Matrigel的tranwell小室观察miR-146a表达升高对MKN-45细胞迁移和侵袭的影响;非标记定量鸟枪法蛋白质组学分析miR-146a高表达后MKN-45胃癌细胞蛋白质谱表达的改变,并用Western blot验证蛋白变化。结果:1. miR-146a在胃癌组织中表达下降。在本实验的43例胃癌中,有36例（84%） miR-146a表达下降,下降倍数平均值为0.34。其中,26例（60%）下降倍数在0.5以下。2. miR-146a在胃癌中的表达水平与肿瘤细胞的分化程度和肿瘤大小相关,其miR-146a表达水平越低,肿瘤细胞的分化越差,肿瘤的体积越大。3. miR-146a低表达和胃癌患者总生存期相关,miR-146a高表达患者总生存时间为27.93个月,而miR-146a低表达患者总生存时间为15.39个月,有统计学差异（P=0.011）。4. miR-146a在四种胃癌细胞系中表达都低于胃粘膜上皮永生化细胞GES-1,且具有统计学意义（p=0.000）。将GES-1中miR-146a表达量设为1,miR-146a的相对表达在高分化胃癌细胞MKN-28中为0.742,人中分化胃癌细胞株SGC-7901为0.013,低分化胃癌细胞MKN-45为0.004,BGC-823为0.005;miR-146a在MKN-45细胞中表达最低,我们选择该细胞系进行后续实验。5.转染了miR-146a mimics的MKN-45细胞的OD值在48h和72h后明显较阴性对照组低,差异具有显著性,24h和48h P值分别为P=0.001,P=0.000。说明miR-146a能够抑制MKN-45细胞的增殖。6. miR-146a高表达对MKN-45细胞周期分布无影响,但是能促进细胞凋亡,转染miR-146a mimics的MKN-45细胞凋亡为11.9%,转染mimics NC对照细胞凋亡率为5.9%。7.“scratch wound healing”实验显示高表达miR-146a降低MKN-45细胞迁移能力,转染miRNA mimics control的MKN-45细胞在48h后划痕基本愈合,而转染miR-146a的MKN-45细胞在48h后划痕仍有相当的距离没有愈台;铺或者不铺matrigel的tranwell小室试验结果显示,相对于阴性对照组,高表达miR-146a的细胞穿过小室底膜的细胞数明显低于对照组,提示高表达miR-146a可以降低MKN-45细胞的迁移和侵袭能力。8.转染miR-146a minics的MKN-45细胞中,5μg/mL oxaliplatin引起的细胞凋亡率比阴性对照组高了13.1%,20ng/mL docetaxcel引起的细胞凋亡率比阴性对照组高了18.6%,说明上调miR-146a可以提高MKN-45细胞对oxaliplatin,docetaxcel的敏感性。9.非标记定量鸟枪法蛋白质组学结果显示,相对于对照细胞,在高表达miR-146a的MKN-45细胞有116种差异表达的蛋白,其中有49个蛋白表达下调,67个蛋白表达上升。表达下调的蛋白中,有8个是miR-146a的预测潜在靶基因,ACADM,COPB1,EGFR,EIF5B,GFPT1,L1CAM,RPL10,SMARCC2。表达上升的蛋白中,有15个是miR-146a的预测潜在靶基因。miR-146a可能不但可以抑制靶基因的表达,也可以上调靶基因的表达。miR-146a高表达后,和增殖凋亡相关蛋白EGFR,VDAC1等表达下降,PDCD6,PDCD4,DDX3等表达上升;侵袭和转移相关蛋白L1CAM,ROCK2,RBBP7等表达下降,Dsc2,SELENBP1,SNX1等表达上升;和紫杉醇类和铂类药物的敏感性相关蛋白IMPDH2,RPN2和DNA修复蛋白PRKDC等表达下降,PDCD4,SELENBP1等表达上升。除此以外,miR-146a高表达后嘌呤从头合成相关的GART表达下降。Western blot证实miR-146a高表达后,MKN-45细胞L1CAM和EGFR蛋白表达下降。结论miR-146a在胃癌组织和细胞系中表达均下降。miR-146a在胃癌组织低表达与肿瘤细胞的分化程度和肿瘤大小,胃癌患者总生存期相关。高表达miR-146a能够抑制胃癌MKN-45胞的增殖,促进细胞凋亡,但是不影响细胞周期分布。高表达miR-146a能够抑制胃癌MKN-45细胞的迁移和侵袭能力。高表达miR-146a可以提高MKN-45细胞对oxaliplatin,docetaxcel的敏感性。蛋白质组学发现高表达miR-146a的胃癌MKN-45细胞49个蛋白表达下调,67个蛋白表达上升,这些蛋白中有和增殖凋亡,侵袭和转移,紫杉醇类和铂类药物敏感性相关的蛋白,为进一步探讨146a在胃癌中的生物学功能的分子机制提供了线索。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 一、胃癌概述
• 二、miRNA概述
• 三、microRNA-146a和肿瘤
• 四、蛋白组学简介
• 第一部分 miR-146a 在胃癌组织中的表达及临床意义
• 引言
• 实验材料
• 实验步骤和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 高表达miR-146a 对胃癌MKN-45 细胞生物学行为的影响
• 引言
• 实验材料
• 实验步骤和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分 应用蛋白质组学技术分析miR-146a 影响胃癌MKN-45 细胞功能的蛋白质表达谱的改变
• 引言
• 实验材料
• 实验步骤和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 总结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的文章
• 致谢