抗体产生过程中DNA脱甲基化对抗体基因的影响

论文摘要

目的：研究抗体产生过程中DNA脱甲基化对抗体基因的影响并初步探讨其相关机制。方法：用DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-Aza）诱导小鼠基因组脱甲基化，利用甲基化敏感性限制性内切酶-PCR法和银染法分析抗体基因整体脱甲基化状态；并利用亚硫酸盐修饰法和real time-PCR检测抗体基因H链和κ链启动子区局部位点脱甲基化状态。用酶联免疫吸附法（ELISA）检测小鼠抗体效价并用PCR和测序法检测抗体基因可变区突变及重排。采用四唑氮盐比色法（MTT法）和流式细胞术检测5-Aza对小鼠脾细胞生长抑制和细胞周期的影响。另外，采用real time-PCR检测白介素（IL）-2、IL-4、IL-6、Toll样受体（TLR）4、TLR9、主要组织相容性复合物（MHC）Ⅰ、MHCⅡ和干扰素（IFN）-γ启动子区脱甲基化水平，并用RT-PCR检测IL-2、IL-4、IL-6、TLR4、TLR9、MHCⅠ、MHCⅡ、IFN-γ、DNA甲基转移酶（Dnmt）1、Dnmt3a和Dnmt3b的mRNA表达水平。结果：（1）注射5-Aza的小鼠的抗体效价比对照组高；（2）注射5-Aza小鼠的抗体基因H链和κ链启动子区甲基化程度以及整体甲基化程度都低于对照组；（3）DNA脱甲基化可引起较高频率点突变，且大部分突变的位点和类型相同；（4）DNA脱甲基化对小鼠脾细胞抗体基因V（D）J区重排并未产生影响；（5）5-Aza对DNA甲基转移酶的表达水平无明显差异；（6）5-Aza可抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡，对细胞周期有一定阻滞作用；（7）脱甲基化组IL-2、IL-4、TLR9、IFN-γ启动子区甲基化程度低于对照组，其mRNA表达水平高于对照组。结论：5-Aza可诱导DNA脱甲基化，且抗体产生过程中抗体基因脱甲基化可促进抗体的产生并引起抗体基因可变区不同程度的突变；抗体产生过程中DNA脱甲基化促进的抗体产生并非由5-Aza促进免疫细胞增殖而促进抗体产生，可能是因为IL2、IL4、TLR9、IFN-γ等免疫相关因子启动子区脱甲基化后上调其转录水平，从而刺激B淋巴细胞分化，进而促进抗体的产生。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 免疫球蛋白基因及抗体多样性
• 1.1.1 Ig 重链基因的结构和重排
• 1.1.2 Ig 轻链基因的结构和重排
• 1.2 DNA 甲基化及其生物学意义
• 1.2.1 DNA 甲基化
• 1.2.2 甲基转移酶
• 1.2.3 DNA 甲基化的生物学意义
• 1.3 免疫相关因子
• 1.3.1 IFN-γ
• 1.3.2 MHC
• 1.4 甲基化和免疫系统
• 1.4.1 甲基化和 V（D）J 重排
• 1.4.2 脱甲基化和 V（D）J 重排
• 1.4.3 B 细胞发育后期阶段的脱甲基化
• 1.4.4 脱甲基化和重排过程动力学
• 1.4.5 κ链脱甲基化分子机制
• 1.5 本课题研究的目的意义及主要内容
• 1.5.1 本课题研究的目的及意义
• 1.5.2 本课题研究的主要内容
• 第二章 DNA 脱甲基化对抗体产生及抗体基因变化趋势的影响
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 pspa 表达及纯化
• 2.2.2 抗体效价测定
• 2.2.3 抗体基因启动子区甲基化检测
• 2.2.4 抗体基因整体甲基化检测
• 2.2.5 抗体基因可变区突变检测
• 2.2.6 抗体基因重排检测
• 2.2.7 甲基转移酶 mRNA 水平检测
• 2.3 本章小结
• 第三章 DNA 脱甲基化促进抗体产生初步机理探讨
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 5-Aza 对脾细胞生长的影响
• 3.2.2 5-Aza 对脾细胞周期的影响
• 3.2.3 免疫相关因子 mRNA 水平检测
• 3.2.4 免疫相关因子启动子区甲基化水平检测
• 3.3 本章小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历