猪脂肪沉积三个候选基因的分子生物学基础研究

论文摘要

本文主要在分子和细胞水平上研究了猪脂肪沉积代谢相关的三个候选基因。脂肪甘油三酯脂酶（Adipose Triglyceride Lipase,ATGL）是2004年由几个不同的实验室采用不同的方法相继发现的一种新的甘油三酯水解酶,官方命名为PNPLA2,又名为iPLA2ζ,desnutrin,TTS2.2和PEDF-R等。该酶主要水解甘油三酯（TG）的第一酯键产生甘油二酯（DAG）,然后激素敏感脂肪酶（HSL）降解甘油二酯为游离脂肪酸（FFA）。因此,ATGL与HSL一起协同消耗哺乳动物体内储存的脂肪。脂联素（Adiponectin,Acrp30）首次发现于1995年,现在研究证明它是机体的脂质代谢和血糖稳态的调控网络中的重要调节因子。Adiponectin由脂肪细胞分泌后进入血液,以多种形式在血液中循环。脂联素球状区在体内独立存在,与完整的脂联素功能相似。脂联素能够促进肌肉脂肪酸氧化、降低血浆甘油三酯、通过增强胰岛素的敏感性而促进葡萄糖代谢。目前已经发现人脂联素基因的多态性与肥胖、胰岛素敏感性和2型糖尿病有关。抵抗素（Resistin,RSTN）首次发现于2001年,是一种典型的脂肪细胞因子。Resistin的重要生理作用就是将肥胖与胰岛素抵抗联系起来,其进一步深入研究对于预防、检测和治疗2型糖尿病具有重要指导意义。鉴于ATGL在脂质代谢和脂肪沉积中的重要作用,我们针对猪ATGL基因开展了对分子水平上的研究,包括全长cDNA和DNA的分离、mRNA组织表达谱分析、多态性位点的检测与遗传效应分析、启动子活性分析、融合蛋白表达定位及转染细胞克隆筛选等。同时,我们还选取猪脂联素和抵抗素基因为脂肪沉积和胴体性状的重要候选基因,重点开展了序列分离和有效分子标记鉴定的工作。关于猪ATGL、Acrp30和RSTN基因的研究,初步的结果如下:1.猪ATGL基因（1）全长cDNA的克隆与鉴定。结合EST序列拼接和cDNA末端快速扩增的方法,获得了猪ATGL基因的全长cDNA序列。发现猪ATGL基因编码区为1461bp,编码486个氨基酸（aa）,分子量大小为53.2 kDa,等电点为7.90。与其它物种一样,猪ATGL蛋白N端预测含patatin脂肪酶结构域,同时含丝氨酸酯酶的α/β水解酶折叠结构和催化二元组基序（GXSXG和DXG/A）,对应的活性残基为Ser47和Asp166;物种间同源性比较发现猪ATGL与牛、狗、小鼠、大鼠、人同源性较高（＞83%）且遗传进化关系距牛最近。（2）全长基因组DNA的分离与鉴定。结合染色体步移获得猪ATGL基因全长基因组DNA序列7044bp。结合物种间同源比较发现该基因含9个编码外显子,且所有的内含子和外显子的拼接都符合GT/AG规则。（3）启动子序列的获得及生物信息学分析。利用基因组步移法扩增得到猪ATGL基因5′侧翼998bp的序列。利用NNPP、MotifFinder、TFSEARCH、CPGPLOT、SignalScan等软件对该基因的核心启动子、转录起始位点、CpG岛的分布以及与启动子相结合的转录因子进行了预测和分析,发现翻译起始密码子ATG上游164bp处为转录起始,204bp到155bp之间存在核心启动子,同时预测到含有帽子信号、TATA框、GC盒、CAAT和GATAs等顺式元件和CREBP1、MyoD、C/EBP等转录因子结合位点。另外,在ATGL基因的上游调控区发现2处突变。（4）染色体精细定位。利用猪-仓鼠辐射杂交克隆板定位（IMpRH）成功将猪ATGL基因定位于SSC2p17（LOD=10.26）,即SSC2p末端,而该区刚好存在一个影响背膘厚的QTL。（5）多态位点的扫描。以瘦肉型猪种（大约克夏、长白、杜洛克猪等）和脂肪型中国地方猪种（梅山猪等）为研究材料,扫描ATGL基因在不同猪种的序列遗传变异,发现了编码区序列存在11处单核苷酸变异。（6）G392A突变的遗传效应分析。发现patation保守结构域内第392位核苷酸G/A突变（G392A）,导致第131位的Arg/His变异（R131H）。通过建立一种快速灵敏的引物突变和PCR-RFLP法在不同群体中对该位点的等位基因频率分布进行扫描,发现该位点在大白和长白猪中A等位基因占优势,频率分别为73%和80%;而脂肪型梅山猪中G等位基因占优势（73%）。遗传效应分析发现该位点与几乎所有的脂肪相关检测性状都极显著或显著相关,包括皮下脂肪和内脏脂肪相关性状、瘦肉率、眼肌性状、肋骨数等。根据TOPpred软件预测发现,该突变可能位于邻近第三跨膜区（141-161aa）的膜内区（64-140aa）;而且该突变又是位于patation功能域内,所以R131H突变极有能对ATGL的空间结构或激活水平产生影响。（7）组织转录表达谱。利用荧光实时定量RT-PCR技术进行ATGL基因mRNA表达谱分析,发现皮下脂肪组织中超高量特异表达,肌肉、小肠和心脏中等表达,而在肝、脾、肺、胃、肾和卵巢中几乎检测不到表达。（8）启动子活性分析。构建了7个含猪ATGL基因翻译起始上游序列的不同缺失片段的荧光素酶报告基因表达载体,分别为pGL3-Q1（-998bp～+45bp）、pGL3-Q2（-788bp～+45bp）、pGL3-Q3（-631bp～+45bp）、pGL3-Q4（-568bp～+45bp）、pGL3-Q5（-472bp～+45bp）、pGL3-Q6（-367bp～+45bp）和pGL3-Q7（-198bp～+45bp）,用Lipofectamine2000瞬时转染COS-7细胞株,48小时后双荧光素酶报告基因检测系统在生物发光仪中检测。结果分析表明,最小核心启动子区于-367bp～-164bp处,-568bp～-367bp存在正调控元件,-788bp～-568bp存在负调控元件。（9）融合蛋白表达。构建了不同缺失蛋白的EGFP融合表达载体pATGL/EGFP、pATGL-pat/EGFP、pATGL-Npat/EGFP、pATGL-Fab/EGFP和pHSL/EGFP,转染猪肾细胞系IBRS-2和猪原代脂肪细胞,并对转染后蛋白的表达在激光共聚焦显微镜下观察,发现只有完整的HSL和ATGL蛋白才定位于细胞质,而其他三个ATGL缺失蛋白与EGFP融合表达的产物弥散分布于整个细胞中。（10）G418筛选细胞克隆。确定本实验室IBRS-2细胞的最佳G418筛选浓度为800μg/mL。经G418筛选和有限稀释法反复筛选成功获得绿色荧光蛋白分别与ATGL和HSL融合表达的IBRS-2细胞克隆（pATGL/EGFP、pHSL/EGFP）,能在体外连续传代过程中持续表达绿色荧光。2.关于猪Acrp30的分子标记筛选（1）外显子2的178bp处存在A/G变异。该位点引起异亮氨酸（Isoleucine）和缬氨酸（Valine）的变异,并引起内切酶AcyⅠ的酶切多态性。利用AcyⅠPCR-RFLP的方法,对五个品种猪（国外品种大白、长白和杜洛克猪,国内品种梅山和清平猪）进行了基因型分型。结果发现国内品种脂肪型猪中A等位基因占绝大多数,而检测的国外纯种瘦肉型猪中全都是B等位基因。为检测该多态性与脂肪相关性状值间的关系,在267头“大白×梅山”F2资源群体中进行与胴体性状的关联分析。结果发现该位点多态性与众多脂肪沉积和胴体性状显著相关。G等位基因频率的增加,有利于增加眼肌面积、瘦肉率和骨率,减少肩部最厚处背膘厚、6-7腰椎背膘厚、胸腰椎间背膘厚和臀部背膘厚等。A178G（Ile60Val）的变异位于猪脂联素胶状区的第60位氨基酸,可能影响到其高级结构的形成,进而影响到翻译后修饰和多聚体的生物学活性。猪脂联素基因该功能性位点的首次发现为该基因作为脂肪沉积相关性状重要候选基因进一步提供了依据。（2）内含子2中第958位的A/G突变。用PCR-SSCP检测了三个品种猪的基因型分布,发现检测的国内品种梅山猪中都为G等位基因,而国外品种大白和长白猪中都为A等位基因。在273头“大白×梅山”F2资源家系群体中进行统计分析表明,A等位基因有利于增加眼肌宽、眼肌面积和瘦肉率,并减少肩部背膘厚、6-7腰椎间背膘厚和平均背膘厚。3.关于抵抗素的分子标记筛选发现318-331bp处的14bp插入/缺失突变,设计引物在大白、长白和梅山等纯种和大梅F2群体中扩增出含该位点的482/468 bp的PCR产物,并通过非变性8%聚丙烯酰胺凝胶电泳对该位点多态性的分布进行分析。绝大部分都为缺失纯合型（AA）和杂合型（AG）,插入突变占少数。其中,国外品种大白和长白都为缺失纯合型（AA）,国内品种梅山有三种基因型。在127头“大白×梅山”F2资源群体中进行与胴体性状的相关统计分析发现AA型群体具有较低的肥肉率、肩部最厚处背膘厚、6-7肋骨处背膘厚、胸腰椎间背膘厚、臀部背膘厚、平均背膘厚、板油重和花油重,以及较高的瘦肉率和胴体长等。

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摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

1 动物脂肪组织的形成机理

1.1 脂肪细胞的决定与分化

1.2 脂肪的沉积与动员

1.2.1 脂滴的形成

1.2.2 参与的调控网络

1.2.3 异常的沉积或动员

2 脂肪沉积相关候选基因的研究进展

2.1 脂肪甘油三酯脂肪酶基因（adipose triglyceride lipase,ATGL）

2.1.1 ATGL的发现过程

2.1.2 ATGL的分子结构

2.1.3 ATGL的脂肪酶功能

2.1.4 ATGL的表达规律

2.1.5 ATGL的调控模式

2.1.6 ATGL的应用前景

2.2 脂联素基因（Adiponectin,Acrp30）

2.2.1 脂联素基因的分子生物学特征

2.2.2 脂联素的生物学结构

2.2.3 脂联素的生物学功能

2.2.4 脂联素的调控

2.2.5 应用前景

2.3 抵抗素基因（Resistin,RSTN）

2.3.1 抵抗素的分子生物学特征

2.3.2 抵抗素和肥胖

2.3.3 抵抗素的表达调控

2.3.4 猪抵抗素的研究进展

3 研究目的与意义

第二章猪ATGL基因的分子生物学研究

1 引言

2 试验材料

2.1 猪组织样品

2.2 猪DNA样品

2.2.1 猪血液样品

2.2.2 猪辐射杂种克隆板（IMpRH）

2.3 质粒、菌种和细胞

2.4 引物设计与合成

2.5 主要仪器设备和器皿

2.6 主要药品及试剂

2.7 缓冲液及常用试剂的配制

2.8 主要生物学软件

3 试验方法

3.1 猪组织总RNA的提取

3.2 猪ATGL基因cDNA的分离

3.2.1 EST拼接验证

3.2.2 3'RACE-PCR

3.2.2.1 第一链的合成

3.2.2.2 降落PCR扩增

3.2.3 5'RACE-PCR

3.2.3.1 第一链的制备与纯化

3.2.3.2 第一链cDNA末端加尾

3.2.3.3 巢式扩增

3.3 猪ATGL基因DNA序列的分离

3.3.1 猪血液基因组DNA的提取

3.3.2 猪ATGL基因内含子的PCR扩增

3.3.3 染色体步移

3.3.3.1 基因组步移库DNA的提取

3.3.3.2 基因组DNA的质量检测

3.3.3.3 基因组DNA的消化

3.3.3.4 基因组DNA的纯化

3.3.3.5 连接接头

3.3.3.6 基因组PCR步移

3.4 外源片段回收、克隆和测序

3.4.1 PCR产物的回收

3.4.2 载体连接

3.4.3 连接产物的转化

3.4.4 阳性克隆子鉴定及测序

3.5 猪ATGL基因染色体精细定位

3.5.1 定位引物的设计

3.5.2 PCR扩增分型方法

3.5.2.1 PCR预扩增

3.5.2.2 对RH panel扩增

3.5.3 数据分析方法

3.6 猪ATGL转录水平组织表达谱分析

3.6.1 cDNA第一链的合成

3.6.2 引物设计

3.6.3 实时荧光定量PCR

3.7 表达载体的构建

3.7.1 目的片段的获得

3.7.1.1 启动子缺失片段的获得

3.7.1.2 编码区段的获得

3.7.2 目的片段与载体的连接

3.7.2.1 目的片段与载体的双酶切

3.7.2.2 酶切后目的片段与线性载体的连接

3.7.3 重组质粒的转化和鉴定

3.8 重组质粒的中量提取

3.9 细胞的培养

3.9.1 细胞系的培养与传代

3.9.2 猪原代脂肪细胞的培养

3.9.3 细胞转染

3.9.4 克隆筛选

3.10 双荧光素酶活性测定

3.10.1 细胞裂解

3.10.2 双荧光素酶活性测定

3.10.3 数据处理及统计分析

3.11 融合蛋白在体外细胞的表达定位

4 结果与分析

4.1 总RNA的提取

4.2 总DNA的提取及基因组步移库的构建

4.3 猪ATGL基因全长cDNA的克隆及特征分析

4.3.1 猪ATGL基因全长cDNA的扩增及测序

4.3.2 猪ATGL基因cDNA序列的生物信息学分析

4.3.2.1 基本序列信息

4.3.2.2 高级结构域预测

4.3.2.3 潜在的miRNA预测

4.4 猪ATGL全长基因的克隆

4.4.1 猪ATGL基因DNA片段扩增结果

4.4.2 猪ATGL基因DNA序列生物信息学分析

4.4.2.1 猪ATGL基因的外显子和内含子组成

4.4.2.2 猪ATGL基因与下游基因的线性排列

4.4.2.3 猪ATGL基因上游的潜在转录调控区

4.5 猪ATGL基因的染色体精细定位

4.5.1 猪ATGL基因特异片段的扩增与验证

4.5.2 利用IMpRH将猪ATGL基因定位于SSC2p17

4.6 猪ATGL转录物在脂肪组织中的高效表达

4.7 体外细胞中猪ATGL基因的启动子活性

4.7.1 猪ATGL基因启动子缺失片段的获得

4.7.2 荧光素酶报告基因表达载体的构建

4.7.3 不同表达载体的荧光素酶相对活性

4.8 猪ATGL及HSL融合蛋白的体外表达定位

4.8.1 真核表达载体的构建

4.8.2 融合蛋白的表达定位

4.8.3 细胞稳定转染的筛选

4.8.3.1 最佳筛选浓度的确定

4.8.3.2 稳定转染的筛选

5 讨论

5.1 关于猪ATGL基因的遗传信息

5.1.1 ATGL基因在染色体上的位置

5.1.2 猪ATGL基因的结构

5.2 关于猪ATGL基因上游启动子的转录活性分析

5.2.1 为什么研究启动子

5.2.2 双荧光素酶报告基因在启动子研究中的优势

5.2.3 猪ATGL最小启动子的进一步解析

5.3 真的存在miRNA的转录后调控吗

5.3.1 miRNA的转录后微调

5.3.2 关于猪ATGL基因下游转录后微调的分析

5.4 关于体外细胞的融合表达

5.4.1 猪ATGL和HSL蛋白在体外细胞的表达定位

5.4.2 利用pEGFP-N1构建融合表达载体的注意事项

5.4.3 关于转染细胞克隆的G418筛选

5.5 关于猪ATGL蛋白的生物学功能

5.6 关于猪ATGL的下一步计划和应用展望

第三章猪ATGL、Acrp30和RSTN基因的SNPs及遗传效应分析

1 引言

2 试验材料

2.1 试验猪群体和性状测定

2.2 主要仪器设备及试剂

2.3 主要生物学软件

3 试验方法

3.1 候选基因的SNP筛查与检测

3.1.1 猪ATGL基因外显子2 G392A突变

3.1.2 猪Acrp30外显子2的A/G突变

3.1.3 猪Acrp30基因内含子2的A/G突变

3.1.4 猪RSTN基因14bp的缺失/插入突变

3.2 统计分析

4 结果与分析

4.1 猪ATGL基因的SNP检测及遗传效应分析

4.1.1 猪ATGL基因的SNP扫描结果

4.1.2 外显子2 G392A的PCR-RFLP结果

4.1.3 外显子2 G392A的多态性分布

4.1.4 外显子2 G392A的遗传效应分析

4.2 猪Acrp30基因的SNP检测及遗传效应分析

4.2.1 猪Acrp30基因外显子2 A178G位点分析

4.2.1.1 外显子2 A178G的PCR-RFLP结果

4.2.1.2 外显子2 A178G的多态性分布

4.2.1.3 外显子2 A178G的遗传效应分析

4.2.2 猪Acrp30基因内含子2 A958G位点分析

4.2.2.1 内含子2 A958G的PCR-SSCP结果

4.2.2.2 内含子2 A958G的测序验证

4.2.2.3 内含子2 A958G的多态性分布

4.2.2.4 内含子2 A958G的遗传效应分析

4.3 猪RSTN基因的SNP检测及遗传效应分析

4.3.1 猪RSTN基因的SNPs扫描结果

4.3.2 内含子2缺失/插入的PCR-PAGE结果

4.3.3 内含子2缺失/插入的多态性分布

4.3.4 内含子2缺失/插入的遗传效应分析

5 讨论

5.1 猪ATGL基因多态位点的遗传效应与分子机制

5.1.1 遗传效应分析

5.1.2 可能的分子机制

5.2 猪Acrp30的多态位点的遗传效应与分子机制

5.2.1 猪Acrp30外显子1 A178G的遗传效应及分子机制

5.2.2 猪Acrp30内含子2 A/G的遗传效应

5.3 猪RSTN基因多态位点的遗传效应

5.4 内含子SNPs的分子机制分析

小结

参考文献

附录1 资源家系测定性状的英文缩写

附录2 PGL3-Q重组质粒序列

附录3 EGFP融合表达载体测序结果

致谢

在读期间发表论文情况

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