论文摘要
目的丙型肝炎病毒(HCV)是慢性肝炎的主要病原之一,目前世界上约有1.7 亿人被感染,常导致严重肝病,包括肝硬化和肝细胞癌(HCC)。HCV的基因组含有一个长的开放读码框(ORF),编码一个约3010 个氨基酸残基(aa)组成的多蛋白,该多蛋白被细胞和病毒蛋白酶切割产生至少10 个病毒基因产物。p7 蛋白是其中之一,在脂质膜中形成六聚体阳离子通道,金刚烷胺和长烷基链的亚氨基糖衍生物可抑制p7 形成的阳离子通道。p7 对HCV病毒颗粒的感染产生是必需的,但关于其功能研究知之甚少,本研究旨在探讨p7 蛋白在HCV 致病过程中的作用。方法1. 构建p7 的真核表达载体pcDNA3.1(-)-p7,将其与pCAT3-Promoter 共转染人肝癌细胞系HepG2,48 h 后收获细胞,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。2. 以表达质粒pcDNA3.1(-)-p7 瞬时转染HepG2 细胞,并以空载体pcDNA3.1(-)做为平行对照,制备转染后的细胞裂解液。应用抑制性消减杂交(SSH) 技术,构建p7 反式调节相关基因差异表达的cDNA 消减文库,筛选相关的靶基因片段,将产物与T/A 载体连接,构建cDNA 消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆,PCR 扩增后进行测序及同源性分析。对转染后的细胞裂解液同时应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析。3. 构建去唾液酸糖蛋白受体1(ASGPR1)启动子的报告基因载体pCAT3-ASGPR1p,并以其转染肝癌HepG2 细胞系,用ELISA 法检测CAT的表达活性,并与pcDNA3.1(-)-p7 共转染HepG2 细胞系,用ELISA 法检测CAT 的表达活性。结果1. pCAT3-promoter 和pcDNA3.1(-)-p7 共转染的HepG2 细胞的CAT 表达活性较pCAT3-promoter 下降了87%。2. 成功构建人HCV p7 蛋白反式调节相关基因差异表达的cDNA 文库,包括15 个上调基因和6 个下调基因。我们提取高质量的总RNA 并进行逆转
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