论文摘要
目的:本实验通过研究SCI后MMP-9表达和细胞凋亡规律,以及MMP-9表达与细胞凋亡的相关性,探讨MMP-9在SCI后继发性细胞凋亡中的作用,为继发性脊髓损伤的治疗提供新的思路。并探讨甲基强的松龙对SCI后神经细胞凋亡的影响及其作用机理,为甲基强的松龙治疗脊髓损伤提供新的理论依据。方法:成年雄性SD大鼠126只,随机分为三组:假手术组（sham operation group, SO group）、单纯损伤组（Spinal cord injury group, SCI group）和MP治疗组（MP treatment group, MP group）。10%水合氯醛麻醉后,假手术组42只,仅做T9-10节段椎板切除术;单纯损伤组42只,暴露T9-10节段脊髓,按改良Allen’s法,将10g条形重物通过导管,从5cm高度垂直落下打击该段脊髓背侧正中制作SCI模型。MP治疗组42只,用同样的打击方法损伤脊髓T9-10节段,并于术后30min从大鼠尾静脉内静注大剂量甲基强的松龙（Methylprednisolone, MP）（30mg/kg）。三组大鼠均于SCI后1h、6h、12h、1d、3d、5d、7d（每个时间点n=6）处死大鼠取材。采用苏木精-伊红染色（HE）观察损伤脊髓组织病理改变,免疫组织化学染色观察损伤脊髓组织MMP-9表达并测平均光密度值（Optical density, OD）,原位缺口末端标记法（TUNEL法）观察损伤脊髓组织细胞凋亡并计算凋亡指数（Apoptotic Index,AI）。分别对各时间点损伤脊髓组织MMP-9平均光密度和细胞凋亡指数进行组间、组内比较,并对单纯损伤组各时间点MMP-9平均光密度和细胞凋亡指数进行相关性分析。结果:①免疫组织化学染色显示:假手术组各时间点均未见MMP-9阳性细胞表达。单纯损伤组SCI后1h,损伤段脊髓可见MMP-9阳性细胞表达,6h表达增高,1d达高峰（MMP-9平均光密度0.310±0.019）,维持到3d （MMP-9平均光密度0.261±0.024）,然后开始减少,7d仍有表达,阳性细胞主要表达在缺血神经元、血管内皮细胞和中性粒细胞,灰质和白质均有表达。假手术组和单纯损伤组各时间点MMP-9平均光密度值比较有显著差异（p<0.05）。单纯损伤组SCI后各时间点MMP-9平均光密度值比较显示,1d与其余各时间点比较均有显著性差异（p<0.05）,6h与7d比较无差异（p>0.05）。MP治疗组SCI后各相应时间点MMP-9表达的强度较损伤组明显下降,仍是6h表达增高,1d达高峰并维持（MMP-9平均光密度值0.254±0.043）,5d开始减少,7d仍有少量表达。MP治疗组和损伤组各时间点MMP-9平均光密度值比较有显著差异（p<0.05）。治疗组SCI后各时间点MMP-9平均光密度值比较显示,1d与其余各时间点比较均有显著性差异（p<0.05）。②TUNEL法标记结果显示:假手术组各时间点均未见TUNEL标记阳性细胞。单纯损伤组TUNEL标记阳性细胞1h开始出现,6h逐渐增加,1d达高峰（平均凋亡指数31.176±3.091）,5d表达减少,7d仍有表达。阳性细胞主要见于灰质的神经元,神经胶质细胞中也有表达。单纯损伤组和假手术组各时间点凋亡指数比较有显著差异（p<0.05）。单纯损伤组SCI后各时间点凋亡指数比较显示,1d与其余各时间点比较均有显著性差异（p<0.05）,5d与12h比较无差异（p>0.05）。MP治疗组SCI后各相应时间点TUNEL标记的阳性细胞数较损伤组明显减少,仍是6h表达增高,1d达高峰并维持（平均凋亡指数21.928±2.141）,5d开始减少,7d仍有少量表达。MP治疗组和单纯损伤组各时间点凋亡指数比较有显著差异（p<0.05）。MP治疗组SCI后各时间点凋亡指数比较显示,1d与其余各时间点比较均有显著性差异（p<0.05）, 5d与12h比较无差异（p>0.05）, 7d与6h比较无差异（p>0.05）。③单纯损伤组各时间点MMP-9平均光密度值与凋亡指数做相关性分析得出结论:MMP-9的表达量和细胞凋亡指数的变化呈正相关关系（相关系数r=0.936,P<0.05）。结论:①大鼠SCI后损伤节段脊髓组织中MMP-9表达明显增多,24h达高峰,持续至3d后逐渐下降,7d仍有表达,实验结果说明SCI后MMP-9表达与继发性脊髓损伤的病理发展过程有关。②大鼠SCI后损伤节段脊髓组织存在继发性神经细胞凋亡,凋亡指数逐渐增高,24h达高峰,持续至3d后下降,7d仍可见阳性凋亡细胞。实验结果表明SCI后存在着继发性神经细胞凋亡,进一步加重了原发性脊髓损伤。③SCI后损伤节段脊髓组织的MMP-9表达与细胞凋亡呈正相关关系。实验结果说明MMP-9诱导了继发性神经细胞凋亡,与继发性脊髓损伤的发生发展关系密切。④大剂量MP治疗后,损伤脊髓组织的MMP-9表达量与细胞凋亡指数均明显减少。实验结果表明MP抑制了SCI后损伤组织中的MMP-9表达,从而减少了继发性神经细胞凋亡。
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