基于代谢工程理论构建酵母菌株提高乙醇产量的研究

论文摘要

本文依据基元模式分析预测结果,提出构建工程菌株的代谢途径修饰策略。本工作以工业菌株KAM-2（MATαura3）为出发菌株分别缺失基因FPS1、GPD1、GPD2和过量表达基因GLT1,依据酵母等位基因分离方法获得两基因工程菌株KAM-14（MATa ura3 fps1Δ::REPEAT gpd1Δ::REPEAT PpGK1-GLT1）和KAM-15（ MATa ura3 fps1Δ::REPEAT gpd2Δ::REPEAT PpGK1-GLT1）。对KAM-14、KAM-15与KAM-2进行厌氧发酵实验,测定发酵菌株的OD值、葡萄糖消耗量、甘油、乙醇、乙酸和丙酮酸的生成量。实验结果表明,与KAM-2相比,KAM-14和KAM-15发酵的OD值和耗糖量差别不大。同时KAM-14和KAM-15的甘油生成量分别降低39.21%和37.02%,乙醇产量则分别提高12.65%和11.64%;乙酸和丙酮酸产量都显著降低。依据酵母代谢通量模型分别计算在厌氧批发酵条件下KAM-14和KAM-15与KAM-2的代谢通量分布,工程菌株的乙醇代谢通量都有所提高。结果表明,与对照菌KAM-2相比,KAM-14和KAM-15具有更优良的发酵性能,说明本研究提出的代谢途径修饰策略是正确的。本论文在工业菌株和实验室菌株上分别缺失SYM1和过量表达基因SYM1。实验结果表明,过量表达具有耐高温高乙醇的SYM1基因工程菌株未明显改善其生长表型。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 乙醇生产及其与甘油的代谢特点
• 1.1.1 国内外乙醇工业的研究现状
• 1.1.2 乙醇及甘油的代谢特点
• 1.1.2.1 乙醇及甘油代谢机理
• 1.1.2.2 甘油的代谢调控功能
• 1.1.2.3 氨代谢对甘油合成的影响
• 1.2 本实验研究各基因的主要功能特点
• 1.2.1 FPS1 的主要功能
• 1.2.2 GPD1 和GPD2 的主要功能
• 1.2.3 GLT1 的主要功能
• 1.2.4 SYM1 的主要功能
• 1.3 代谢工程应用于乙醇工业的研究进展
• 1.3.1 基元模式分析的研究方法与应用
• 1.3.2 代谢通量分析的研究方法与应用
• 1.4 本文的立题背景、意义及研究思路
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒、菌株和引物
• 2.1.1.1 质粒
• 2.1.1.2 菌株
• 2.1.1.3 引物
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 主要溶液
• 2.1.6 实验发酵液
• 2.1.7 发酵实验
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 2.2.2 质粒的提取（CTAB 法）
• 2.2.3 酵母染色体DNA 的快速分离
• 2.2.4 酵母细胞的转化
• 2.2.5 PCR 扩增反应
• 2.2.6 DNA 的限制酶消化
• 2.2.7 DNA 的连接反应
• 2.2.8 电泳法检测 DNA 凝胶的制备
• 2.2.9 DNA 片段的回收纯化
• 2.2.10 一步基因置换法缺失目的基因
• 2.2.11 两步基因置换法过量表达目的基因
• 2.2.12 不同交配型酵母细胞之间的杂交
• 2.2.13 产孢及四分体孢子拆分
• 2.2.14 酵母交配型的验证
• 第三章 代谢途径修饰策略的提出
• 3.1 结果与讨论
• 3.1.1 实验策略
• 3.1.1.1 酵母代谢途径模型的建立
• 3.1.1.2 突变株修饰策略的提出
• 3.1.2 基元模式分析
• 3.1.2.1 潜在的生长表型
• 3.1.2.2 途径产量的计算
• 3.1.2.3 氧化还原平衡的调节
• 3.2 本章小结
• 第四章 高产乙醇工程菌株的发酵特点
• 4.1 结果与讨论
• 4.1.1 工程菌株的构建
• 4.1.2 菌株生长特性比较
• 4.1.2.1 菌株OD 值
• 4.1.2.2 底物的消耗和pH 变化
• 4.1.2.3 代谢产物的生成
• 4.1.3 讨论与分析
• 4.1.4 结论
• 4.2 本章小结
• 第五章 高产乙醇工程菌株的代谢通量分析
• 5.1 结果与讨论
• 5.1.1 实验方法
• 5.1.1.1 代谢通量模型的建立
• 5.1.1.2 拟稳态方程组的求解
• 5.1.2 KAM-14 的代谢通量分析
• 5.1.3 KAM-15 的代谢通量分析
• 5.2 本章小结
• 第六章 耐高温、耐乙醇基因 SYM1 的特性研究
• 6.1 结果与讨论
• 6.1.1 实验方法
• 6.1.1.1 sym1Δ菌株的构建
• 6.1.1.2 SYM1 基因过量表达菌株的构建
• 6.1.1.3 SYM1 基因可逆生长菌株的构建
• 6.1.2 sym1Δ菌株的生长表型特点
• 6.1.3 SYM1 基因可逆生长菌株的表型特点
• 6.1.4 过量表达基因 SYM1 的 W303 生长特点
• 6.2 本章小结
• 第七章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 本文创新点
• 7.3 展望
• 参考文献
• 发表的论文和参加科研情况说明
• 附录
• 致谢