山羊CAPN1基因和CAST基因Ⅱ型转录本克隆及在不同组织中的表达

论文摘要

钙蛋白酶系统与畜禽肉质性状高度相关,主要包括钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白,钙蛋白酶系统广泛参与机体信号转导、细胞增殖和肌肉生长等生理过程,特别是在肌原纤维更新和宰后肉嫩化中起重要作用。钙蛋白酶（Calpain, CAPN）在生物体内普遍存在,它是一种依钙半胱氨酸蛋白酶,在活体中与肌肉内蛋白质降解等许多细胞过程密切相关,在动物宰后影响肉的嫩度。钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin, CAST）是一种内源性的、需Ca2+激活的钙蛋白酶抑制剂,能抑制肌肉内蛋白质降解,屠宰之后可降低钙蛋白酶的活性,降低蛋白质水解。大量研究表明：CAPN基因及CAST基因将成为研究畜禽肉质性状的重要候选基因。本研究以牛及绵羊的CAPN1基因及CAST基因mRNA序列为基础,采用T-A及RACE的方法分别克隆了山羊CAPN1基因及CAST基因II型转录本（以下简称CASTⅡ基因）,获得了全长2267bp的CAPN1基因cDNA序列及2474bp的CASTII基因cDNA序列,将序列提交至NCBI,获得两个基因登陆号（HQ718593和HM053645）,这是CAPN1基因及CASTⅡ基因在山羊上首次的序列报道。CAPN1基因包括完整的开放阅读框2151bp,编码716个氨基酸；CASTⅡ基因包括完整的开放阅读框1695bp,编码564个氨基酸,氨基酸序列中存在4个保守结构域和1个保守七肽序列。生物信息学分析表明：山羊CAPN1蛋白的氨基酸序列与其它物种（特别是与哺乳动物）的同源性较高,而山羊CASTⅡ蛋白除与绵羊及牛同源性较高外,与其它物种同源性都较低；疏水性分析发现CAPN1蛋白及CASTⅡ蛋白可能都是亲水性的；跨膜性预测显示CAPN1蛋白及CASTⅡ蛋白都不是跨膜蛋白;磷酸化位点预测显示CAPN1氨基酸序列含用24个Ser磷酸化位点,8个Thr磷酸化位点,8个Tyr磷酸化位点；CASTⅡ氨基酸序列含用20个Ser磷酸化位点,14个Thr磷酸化位点,1个Tyr磷酸化位点；二级结构预测显示CAPN1氨基酸序列中包含α-螺旋：42.04%,无规卷曲：43.16%,延伸片断：14.80%；CASTⅡ氨基酸序列包含α-螺旋：25.89%,无规卷曲：71.45%,延伸片断：2.66%。通过实时荧光定量RT-PCR技术分析了CAPN1及CASTⅡ基因在天府肉羊部份组织中的表达情况。结果表明：CAPN1基因及CASTⅡ基因在所选择的天府肉羊7个组织（心、肝、脾、肺、肾、眼肌、腿肌）中均有表达,肌肉组织是表达的优势组织。CAPN1基因在半岁羊的各组织中,腿肌的表达量最高,极显著高于眼肌与肝脏（P<0.01）,眼肌与肝脏的表达量又极显著高于其它组织（P<0.01）；在眼肌组织中,CAPNl基因的表达量随着年龄的增长先增加后降低,在1岁时的表达量最高,极显著高于其它年龄段时的表达量（P<0.01）。CASTⅡ基因在半岁羊的各组织中,眼肌的表达量最高,与腿肌差异显著（P<0.05）,极显著高于内脏各组织（P<0.01）；在眼肌组织中,CASTⅡ基因的表达量随着年龄的增长而增加,3岁时的表达量最高。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 钙蛋白酶系统的研究进展
• 1.1.1 CAPN1的结构及活性调节
• 1.1.2 CAPN1嫩化肌肉的作用机理
• 1.1.3 CAST的结构、作用机理
• 1.2 CAPN1基因的研究进展
• 1.2.1 CAPN1基因的cDNA克隆及定位
• 1.2.2 CAPN1基因与肌肉嫩度、生长及疾病的关系
• 1.3 CAST基因的研究进展
• 1.3.1 CAST基因的cDNA克隆及定位
• 1.3.2 CAST基因与肌肉肉质及生长性状的关系
• 1.4 钙蛋白酶家族相关基因研究进展
• 1.5 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验动物及样品采集
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 试验试剂
• 2.1.4 主要试剂的配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 总RNA的提取
• 2.2.3 cDNA第1链的合成
• 2.2.4 CASTⅡ及CAPN1基因各片段PCR
• 2.2.5 PCR产物的回收纯化
• 2.2.6 PCR产物克隆及测序
• 2.2.7 实时荧光定量PCR
• 2.3 统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 山羊CASTⅡ、CAPN1基因的克隆及序列分析
• 3.1.1 组织总RNA提取
• 3.1.2 RT-PCR
• 3.1.3 目的片段的测序结果
• 3.2 山羊CAPN1基因生物信息学分析
• 3.2.1 序列比对结果
• 3.2.2 山羊CAPN1基因CDS序列的碱基组成
• 3.2.3 山羊CAPN1基因CDS密码子使用及氨基酸组成
• 3.2.4 山羊CAPN1蛋白质磷酸化位点预测
• 3.2.5 山羊CAPN1蛋白质疏水性预测
• 3.2.6 山羊CAPN1蛋白质信号肽分析
• 3.2.7 山羊CAPN1蛋白质跨膜特征
• 3.2.8 山羊CAPN1蛋白糖基化位点分析
• 3.2.9 山羊CAPN1蛋白质二级结构的预测
• 3.2.10 山羊CAPN1保守结构域预测
• 3.2.11 山羊CAPN1基因的系统发育分析
• 3.3 山羊CASTⅡ基因生物信息学分析
• 3.3.1 序列比对结果
• 3.3.2 山羊CASTⅡ基因CDS序列的碱基组成
• 3.3.3 山羊CASTⅡ基因CDS密码子使用及氨基酸组成
• 3.3.4 山羊CASTⅡ蛋白磷酸化位点预测
• 3.3.5 山羊CASTⅡ蛋白疏水性预测
• 3.3.6 山羊CASTⅡ蛋白质信号肽分析
• 3.3.7 山羊CASTⅡ蛋白质跨膜特征
• 3.3.8 山羊CASTⅡ蛋白糖基化位点分析
• 3.3.9 山羊CASTⅡ蛋白质二级结构的预测
• 3.3.10 山羊CASTⅡ保守结构域预测
• 3.3.11 山羊CASTⅡ基因的系统发育分析
• 3.4 荧光定量PCR结果
• 3.4.1 常规PCR检测
• 3.4.2 目的基因与内参基因的熔解曲线和标准曲线
• 3.4.3 CAPN1及CASTⅡ基因组织表达情况
• 4 讨论
• 4.1 RACE技术
• 4.2 克隆cDNA序列分析
• 4.2.1 cDNA序列同源性分析
• 4.2.2 CAPN1及CASTⅡ蛋白疏水性及跨膜性分析
• 4.2.3 CAPN1及CASTⅡ蛋白磷酸化位点及糖基化位点分析
• 4.2.4 CAPN1及CASTⅡ蛋白的二级结构分析
• 4.3 CAPN1、CASTⅡ基因的时空表达分析
• 4.3.1 CAPN1基因的时空表达
• 4.3.2 CASTⅡ基因的时空表达
• 5 结论
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的论文
• 致谢