鸡硒蛋白W基因克隆表达及单克隆抗体制备与鉴定

论文摘要

硒是人和动物生命活动必需的一种重要的微量元素。硒蛋白是硒共价结合在蛋白质中形成硒代半胱氨酸形式。硒蛋白W（SelW）是一种低分子量的细胞内硒蛋白。在不同的生物中,SelW的氨基酸序列高度同源。已有的研究表明SelW在多种组织器官均有表达,且以骨骼肌和脑表达量较高。目前对哺乳动物和啮齿类SelW功能的研究表明,SelW具有调节横纹肌代谢、钙代谢和抗氧化等作用。但是,对于鸡SelW的功能却未见报道。为深入研究鸡硒蛋白W的功能,我们根据鸡SelW的cDNA序列设计引物,对含完整ORF的cDNA序列进行扩增,利用重叠延伸PCR技术对cDNA中的Sec密码子进行突变,经序列分析,结果与参考序列同源性达99%以上,并将突变产物克隆进pGEX-6P-1表达载体,构建重组表达质粒pGEX-SelW,转化到Rosetta宿主菌,经IPTG诱导,实现了重组融合蛋白的高效表达,且均主要以包涵体形式表达,通过切胶的方法纯化重组融合蛋白,再利用凝血酶切掉GST标签,经第二次切胶纯化得到目的蛋白。多克隆抗体经Western blotting表明与相应的GST-SelW融合蛋白反应能产生特异性条带,而与空载体诱导后的GST标签蛋白不反应。纯化蛋白免疫BABL/c小鼠,利用细胞融合技术,经间接ELISA筛选和4次细胞亚克隆,获得2株杂交瘤细胞,分别命名为1B8和4H5。经单克隆抗体亚类试剂盒鉴定,均为IgM类抗体上清滴度分别为1:6400。制备了1B8和4H5腹水单抗,腹水滴度分别为1:12800和1:6400。2株杂交瘤细胞染色体数为103±5,明显多于SP2/0骨髓瘤细胞6575条。2株杂交瘤细胞在体外连续传代3个月和冻存后再复苏均不影响抗体分泌的稳定性。与GST标签和鸡硒蛋白N均无交叉反应。亲和力分析表明,2株单抗对目的蛋白的亲和力高于重组融合蛋白和鸡SelW合成多肽,且亲和力较高,这些为单抗敏感、稳定和快捷的检测应用提供了必要的保证。总之,2株单抗的成功制备为鸡SelW的快速、特异性检测提供了检测试剂,同时也为鸡SelW功能进一步研究提供物质基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1. 引言
• 1.1 硒的发现与研究
• 1.2 硒蛋白的合成及调控
• 1.3 硒蛋白W
• 1.3.1 SelW 的组织分布
• 1.3.2 SelW 的基因结构
• 1.3.3 SelW 的氨基酸序列
• 1.3.4 SelW 蛋白结构
• 1.3.5 食物硒对SelW mRNA 的调控
• 1.3.6 SelW 的功能
• 1.4 杂交瘤单克隆抗体技术
• 1.5 实验的目的意义
• 2. 试验方法与材料
• 2.1 试验试剂与材料
• 2.1.1 试验试剂
• 2.1.2 菌种与载体
• 2.1.3 实验材料
• 2.1.4 实验动物
• 2.1.5 主要试剂的配制
• 2.1.6 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 目的基因原核表达载体构建
• 2.2.2 鸡SelW cDNA 原核表达载体构建
• 2.2.3 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.3 单克隆抗体的制备
• 2.3.1 抗原乳剂的制备
• 2.3.2 动物免疫
• 2.3.3 间接ELISA 检测方法的建立
• 2.3.4 多克隆抗体的特异性鉴定
• 2.3.5 饲养层细胞的制备
• 2.3.6 骨髓瘤细胞的准备
• 2.3.7 脾淋巴细胞的准备
• 2.3.8 细胞融合
• 2.3.9 阳性杂交瘤细胞的筛选
• 2.3.10 阳性杂交瘤细胞的克隆化—有限稀释法
• 2.4 单克隆抗体的大量制备
• 2.4.1 体外培养法
• 2.4.2 体内诱生腹水法
• 2.5 单克隆抗体的部分特性鉴定
• 2.5.1 单克隆抗体上清及腹水效价测定
• 2.5.2 阳性杂交瘤细胞的冻存和复苏
• 2.5.3 单克隆抗体亚类鉴定
• 2.5.4 杂交瘤细胞染色体数鉴定
• 2.5.5 单克隆抗体分泌抗体稳定性鉴定
• 2.5.6 单克隆抗体的特异性分析
• 2.5.7 单克隆抗体亲和度测定
• 3. 试验结果与分析
• 3.1 突变型鸡Sel W cDNA 的制备
• 3.1.1 重叠延伸PCR
• 3.1.2 突变型鸡SelW cDNA 基因的克隆、鉴定及序列测定与分析
• 3.2 鸡Sel W cDNA 原核表达载体构建
• 3.2.1 纯化PCR 扩增产物和载体pGEX-6P-1 双酶切
• 3.2.2 重组质粒的鉴定
• 3.3 重组蛋白的表达与鉴定
• 3.3.1 重组融合蛋白的诱导表达
• 3.3.2 表达条件的常规优化
• 3.3.3 重组蛋白的可溶性分析
• 3.4 凝血酶切除GST 标签并纯化目的蛋白
• 3.5 纯化后目的蛋白浓度
• 3.6 间接ELISA 反应条件的优化
• 3.6.1 抗原与血清工作浓度的确定
• 3.6.2 酶标抗体工作浓度的确定
• 3.6.3 血清作用时间的确定
• 3.6.4 酶标抗体作用时间的确定
• 3.6.5 封闭液与其封闭时间的确定
• 3.6.6 底物显色时间的确定
• 3.7 多克隆抗体的特异性鉴定
• 3.8 杂交瘤细胞系的建立及部分特性鉴定结果
• 3.8.1 细胞融合率
• 3.8.2 单克隆抗体效价测定
• 3.8.3 杂交瘤细胞株分泌抗体的稳定性检测结果
• 3.8.4 单克隆抗体亚类鉴定结果
• 3.8.5 单克隆抗体染色体计数结果
• 3.8.6 单克隆抗体的特异性分析
• 3.8.7 单克隆抗体亲和度测定
• 4. 讨论
• 4.1 目的基因的克隆
• 4.2 表达载体的选择
• 4.3 宿主表达菌的选择
• 4.4 表达条件的常规优化
• 4.5 目的蛋白的表达纯化
• 4.6 间接ELISA 反应条件的优化
• 4.7 抗原制备
• 4.8 实验动物的挑选和免疫
• 4.9 细胞融合
• 4.10 单克隆细胞株筛选
• 4.11 杂交瘤细胞的克隆
• 4.12 污染的预防和排除
• 4.13 单克隆抗体的生物学特性
• 4.13.1 单克隆抗体效价
• 4.13.2 细胞的冻存与复苏
• 4.13.3 单克隆抗体大量制备方法的选择
• 4.13.4 单克隆抗体特异性分析
• 4.13.5 单克隆抗体亲和度的测定
• 5. 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文