甜瓜自交系再生与遗传转化体系的研究及蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因的全长cDNA克隆

论文摘要

甜瓜（Cucumis melo L．）作为葫芦科（Cucurbitaceae）植物中的一种重要的园艺作物，是全世界普遍栽培的重要水果，具有较高的商品价值和经济价值。随着植物细胞工程和基因工程技术的迅速发展，应用组织培养、基因转化等技术手段进行甜瓜品质改良、提高抗逆性、创造新种质，已成为甜瓜育种快速有效的新方法。为满足生产需求而进行组织快繁技术，目前多以生产杂交用种和引进品种为材料进行甜瓜组培再生。在转基因方面，通过农杆菌介导的叶盘法对WMV、CMV、TMV病毒外壳蛋白的遗传转化也有成功的报道。由于杂交种的自交分离而难于应用于遗传育种，本试验以3个不同类型的甜瓜低糖自交系为试材，分别研究了再生、转化体系中的主要影响因素：首次尝试了花粉管通道技术在甜瓜遗传转化方面的应用，并建立了相应的早期快速筛选技术；成功克隆了影响果实糖代谢关键酶SPS基因的全长cDNA序列。主要试验结果如下： 1 甜瓜自交系再生过程中主要影响因素的系统研究 本试验以2个甜瓜低糖高代自交系乌克兰（厚皮甜瓜）、鲁薄一号（薄皮甜瓜）为材料，分别研究了获得高质量无菌苗、外植体类型、无菌苗龄及外植体诱导分化、不定芽伸长生根培养基的激素组合等因素效应，分析了6-BA、ZT、KT、2，4-D、GA、NAA、IAA、IBA等常用植物激素对甜瓜自交系再生转化的影响，并通过器官直接发生途径得到甜瓜不定芽。 试验结果表明，甜瓜种子无菌催芽后培养得到的无菌苗质量最高；乌克兰6d日龄、鲁薄一号4d日龄的子叶柄外植体有利于诱导愈伤组织和不定芽，二者适宜的分化培养基分别为MS+1.0mg／L6-BA+3.0-3.5mg／L ZT+0.1 mg／LNAA、MS+2.0-2.5mg／L BA+0.1mg／L NAA，再生频率分别为45％-55％、50％-60％。6-BA、ZT是甜瓜自交系不定芽分化的主要细胞分裂素，ZT更有利于厚皮甜瓜的诱导分化；KT能够诱导甜瓜自交系不定芽的发生，但后期再生植株上部生长点、新叶坏死，生根一般；2，4-D不能诱导不定芽，却诱导了外植体发生不定根：KT、GA激素配比有利于不定芽的伸长生长：IBA是较为理想的甜瓜生根激素。以器官直接发生途径方式产生不定芽与诱导愈伤组织之间有一定的相关性，即只有诱导了高质量的愈伤组织后才能分化不定芽，无愈伤及诱导了膨松白化愈伤组织的外植体不会分化不定芽。不定芽分化存在明显极性现象，子叶柄的近轴端是诱导不定芽的敏感部位。 2 应用根癌农杆菌介导及花粉管通道法实现了3个甜瓜自交系的遗传转化

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 1.1 甜瓜离体培养、遗传转化研究进展
• 1.1.1 甜瓜离体培养技术的研究与应用
• 1.1.1.1 器官培养.
• 1.1.1.2 甜瓜其他离体培养技术概况
• 1.1.2 甜瓜遗传转化的研究进展
• 1.1.3 前景展望
• 1.2 花粉管通道法在植物遗传转化中应用
• 1.2.1 花粉管通道法的创立与发展
• 1.2.2 花粉管通道法转化机理探讨
• 1.2.3 花粉管通道法操作技术及影响因素
• 1.2.3.1 供体DNA的种类及制备
• 1.2.3.2 花粉管通道法的转化方法及操作技术
• 1.2.3.3 花粉管通道法转化效率的影响因素
• 1.2.4 花粉管通道法在植物遗传转化中的应用研究
• 1.2.5 花粉管通道法转化技术评价及展望
• 1.3 蔗糖磷酸合成酶（SPS）在蔗糖代谢过程中的作用与研究进展
• 1.3.1 SPS的基本性质及生物学功能
• 1.3.2 SPS在植物蔗糖代谢中的作用
• 1.3.3 SPS在果实蔗糖代谢、成熟衰老过程中的作用
• 1.3.3.1 SPS在果实蔗糖代谢过程中的作用
• 1.3.3.2 SPS在果实成熟衰老过程中的作用
• 1.3.4 SPS在甜瓜果实糖代谢过程中的调控作用
• 1.3.5 SPS基因的克隆、遗传转化及应用表达
• 第二章 甜瓜自交系再生体系的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同培养方法对无菌苗生长质量的影响
• 2.2.2 外植体种类对愈伤诱导分化的影响
• 2.2.3 无菌苗日龄对愈伤诱导分化的影响
• 2.2.4 激素对自交系甜瓜不定芽诱导的影响
• 2.2.5 不定芽的伸长生长
• 2.2.6 瓶苗的生根与驯化移栽
• 2.3 讨论
• 2试材缺席'>2.3.1 关于TS₂试材缺席
• 2.3.2 甜瓜不定芽的发生方式
• 2.3.3 激素对甜瓜自交系外植体再生诱导的效应
• 2.3.4 外植体对甜瓜自交系再生诱导的影响
• 第三章 甜瓜自交系遗传转化体系的研究
• 3.1 根癌农杆菌介导的叶盘法转化甜瓜自交系的研究
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.1.2.1 外植体制备
• 3.1.2.2 工程农杆菌的活化及转接
• 3.1.2.3 农杆菌LBA4404、C58感受态的制备
• 3.1.2.4 冻融法转化农杆菌LBA4404、C58感受态细胞
• 3.1.2.5 Kan选择压力及Cef抑菌临界浓度的筛选
• 3.1.2.6 外植体预培养时间
• 3.1.2.7 农杆菌侵染外植体时间
• 3.1.2.8 外植体与农杆菌共培养时间
• 3.1.3 结果与分析
• 1、TS₃试材Kan选择压力的筛选'>3.1.3.1 TS₁、TS₃试材Kan选择压力的筛选
• 3.1.3.2 Cef对农杆菌LBA4404抑制效果的临界浓度筛选
• 3.1.3.3 外植体预培养时间对基因转化的影响
• 3.1.3.4 农杆菌侵染时间对基因转化的影响
• 3.1.3.5 外植体与农杆菌共培养时间对基因转化的影响
• 3.1.4 讨论
• 3.1.4.1 关于农杆菌工程菌株的转接与活化
• 3.1.4.2 Kan选择压及Cef抑菌浓度的筛选
• 3.1.4.3 外植体的预培养、接种及与农杆菌的共培养对转化效果的影响
• 3.1.4.4 利用优化体系对2个甜瓜自交系的转化
• 3.2 花粉管通道法对甜瓜自交系遗传转化的研究
• 3.2.1 试验材料
• 3.2.2 试验方法
• 3.2.2.1 工程菌株Anti-MAI Ⅰ和Anti-MAI Ⅱ质粒提取
• 3.2.2.2 重组子质粒BamH Ⅰ、Kpn Ⅰ的双限制性内切酶酶切
• 3.2.2.3 Anti-MAI Ⅰ和Anti-MAI Ⅱ质粒外源目的基因的PCR验证
• 3.2.2.4 Anti-MAI Ⅰ的Kan抗性基因NPT-Ⅱ的PCR验证
• 3.2.2.5 3个甜瓜自交系花器结构及花粉萌发调查
• 3.2.2.6 花粉管通道技术对甜瓜的转化
• 3.2.3 结果与分析
• 3.2.3.1 反义MAI基因重组子质粒酶切及PCR验证
• 3.2.3.2 3个甜瓜自交系花器调查
• 3.2.3.3 3个甜瓜自交系花粉萌发及花粉管伸长生长
• 3.2.3.4 花粉管通道不同转化方法坐果率及种子数
• 3.2.4 讨论
• 第四章 转基因甜瓜植株的分子检测及田间筛选
• 1、TS₃子叶柄转化植株的检测'>4.1 根癌农杆菌介导TS₁、TS₃子叶柄转化植株的检测
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.1.2.1 CTAB法提取甜瓜叶片基因组DNA
• 4.1.2.2 转基因植株基因组DNA的PCR检测
• 4.1.3 结果与分析
• 1、TS₃植株外源MAI基因检测'>4.1.3.1 农杆菌转化TS₁、TS₃植株外源MAI基因检测
• 1、TS₃植株Kan^r基因NPT-Ⅱ的检测'>4.1.3.2 农杆菌转化TS₁、TS₃植株Kan^r基因NPT-Ⅱ的检测
• 4.1.4 讨论
• 1、TS₂、TS₃甜瓜种子的检测'>4.2 花粉管通道途径获得的TS₁、TS₂、TS₃甜瓜种子的检测
• 4.2.1 试验材料
• 4.2.2 试验方法
• 4.2.2.1 分析纯Kan与药用硫酸阿米卡星注射液的抑制作用
• 4.2.2.2 Kan对甜瓜种子、幼苗的临界浓度筛选
• 4.2.2.3 花粉管通道法转化种子的筛选
• 4.2.3 结果与分析
• 4.2.3.1 分析纯与药用Kan对甜瓜种子萌发抑制的效果比较
• 4.2.3.2 Kan使用方法的效果比较
• 4.2.3.3 3个甜瓜种子Kan临界浓度的筛选
• 4.2.3.4 3个甜瓜幼苗Kan临界浓度的筛选
• 1、TS₂、TS₃花粉管转化种子的筛选'>4.2.3.5 Kan临界浓度对TS₁、TS₂、TS₃花粉管转化种子的筛选
• r绿苗的PCR检测'>4.2.3.6 Kan^r绿苗的PCR检测
• 4.2.3.7 阳性植株的PCR-Southern杂交检测
• 4.2.4 讨论
• 4.2.4.1 Kan作用机理及在转基因植株快速筛选方面的应用
• 4.2.4.2 3个甜瓜自交系Kan选择压的反应效果
• 4.2.4.3 花粉管通道法在甜瓜遗传转化中的应用效果
• 第五章 蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因全长cDNA克隆及植物表达载体的构建
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 宿主菌和质粒载体
• 5.1.3 各种酶及重要试剂溶液
• 5.2 SPS基因全长cDNA克隆及表达载体构建技术流程
• 5.3 试验方法
• 5.3.1 甜瓜叶片总RNA的提取
• 5.3.2 SPS基因5’端大片断的克隆
• 5.3.2.1 引物的设计与合成
• 5.3.2.2 RT-PCR扩增
• 5.3.2.3 DNA目的片断回收
• 5.3.2.4 目的基因的T-克隆
• 2法制备大肠杆菌DH10B感受态细胞'>5.3.2.5 CaCl₂法制备大肠杆菌DH10B感受态细胞
• 5.3.2.6 热击法转化大肠杆菌DH10B感受态细胞
• 5.3.2.7 碱裂解法小量提取大肠杆菌重组子质粒
• 5.3.2.8 重组子质粒EcoRⅠ、BamHⅠ酶切及PCR鉴定
• 5.3.2.9 重组子质粒序列分析
• 5.3.3 SPS基因3’末端小片断的克隆
• 5.3.3.1 引物的设计与合成
• 5.3.3.2 RT-PCR扩增
• 5.3.3.3 DNA目的片断回收、T-克隆
• 5.3.3.4 热击法转化大肠杆菌DH10B、重组子质粒提取
• 5.3.3.5 重组子质粒EcoRⅠ、HindⅢ酶切及PCR鉴定
• 5.3.3.6 Southern杂交筛选3’末端小片断阳性克隆
• 5.3.3.7 重组子质粒序列分析
• 5.3.4 SPS的全序列拼接及亚克隆
• 5.3.4.1 引物的设计与合成
• 5.3.4.2 SPS基因5’端附加接头的大片断扩增
• 5.3.4.3 SPS基因3’端附加接头的小片断扩增
• 5.3.4.4 SPS基因附加接头的全序列扩增
• 5.3.4.5 SPS全序列的T-克隆
• 5.3.4.6 SPS全长基因阳性克隆菌液PCR鉴定及序列测定分析
• 5.3.5 SPS基因正义表达载体的构建及农杆菌转化
• 2的BamHⅠ、KpnⅠ酶切及回收纯化'>5.3.5.1 植物表达载体pROK₂的BamHⅠ、KpnⅠ酶切及回收纯化
• 5.3.5.2 SPS基因亚克隆质粒的BglⅡ、KpnⅠ酶切及回收纯化
• 2表达载体的连接'>5.3.5.3 正义SPS基因与pROK₂表达载体的连接
• 5.3.5.4 热击法转化大肠杆菌DH10B、重组子质粒提取
• 5.3.5.5 正义表达载体重组子质粒XbaⅠ、KpnⅠ酶切验证
• 5.3.5.6 正义表达载体重组子质粒转化农杆菌LBA4404、C58感受态细胞
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 RNA的提取
• 5.4.2 RT-PCR扩增SPS基因5’端大片断
• 5.4.3 SPS基因5’端大片断重组子验证
• 5.4.4 SPS基因5’端大片断序列分析及同源比较
• 5.4.5 RT-PCR扩增SPS基因3’末端
• 5.4.6 SPS基因3’端小片断重组子验证
• 5.4.7 Southern杂交3’末端小片断重组子筛选
• 5.4.8 SPS基因附加酶切位点的5’端和3’端PCR扩增
• 5.4.9 附加酶切位点的SPS全序列PCR扩增及阳性克隆菌液PCR检测
• 5.4.10 SPS基因正义表达载体构建及阳性克隆双酶切鉴定
• 5.4.11 SPS基因的序列分析及编码氨基酸
• 5.5 讨论
• 5.5.1 关于SPS基因全长cDNA序列的克隆
• 5.5.2 SPS基因正义表达载体的构建
• 第六章 总结
• 6.1 本试验的研究结论
• 6.2 本试验的创新点
• 6.3 后续研究设想
• 图版及说明
• 附录ⅠⅡⅢ
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况