有机相中脂肪酶催化合成辣椒素酯的研究

论文摘要

辣椒素酯（Capsiate）类物质，始称类辣椒素类物质（Capsaicinoid-like Substances CLSs），是二十世纪八十年代末从日本的一种甜椒品种中分离得到的一种结构类似辣椒素的酯类物质，即为相对应的辣椒素分子中的-NH-基团被-O-所替代，其生物活性与辣椒素类似。随着非水酶学的发展，有机相中生物催化合成天然产物的研究正在兴起，其中脂肪酶的非水相催化研究最为广泛。本文对利用生物合成方法将辣椒素转化为无辛辣味的辣椒素酯进行了研究，建立了辣椒素酯的实验室制备方法，并对合成壬酸香草醇酯的酶促反应建立了动力学模型，结果如下：第一，本文考察了与天然辣椒素酯结构最接近的壬酸香草醇酯在有机相中用脂肪酶催化合成的方法。结果表明脂肪酶Novozym 435的活性最好，最适条件为：在1mL脱水丙酮中，香草醇与壬酸甲酯的浓度分别为50mmol／L、75mmol／L，酶量为20mg，30℃下反应10h，产率可达到65.9％。所得产物经硅胶柱层析纯化后以UV、IR、1HNMR、13CNMR及MS表征了结构。第二，在上述条件下，以天然辣椒素为原料经甲醇醇解后所得混合辣椒素脂肪酸甲酯，再与香草醇在脂肪酶催化下实现了天然辣椒素酯类物质的酶法合成。产物经硅胶柱层析纯化，经HPLC检测不含辣椒素类物质，其结构以GC-MS进行了表征。第三，进行了菌种培养及发酵产酶条件、酶的固定化及催化转化方法的研究。以假丝酵母菌发酵所得的粗脂肪酶固定化，初步研究了有机相中酶促合成壬酸香草醇酯的方法，结果表明：以微晶纤维素为载体时，产物收率为0.23％；以活性炭为载体时，产物收率为0.33％。第四，研究了转酯反应的动力学，其机制属于双底物的乒乓机制。动力学参数为：Vm=44.84mmol／（min·g）；KmA=1.022mmol／L；KmB=0.056mmol／L。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 研究的意义和目的
• 2 国内外相关研究进展
• 3 非水介质中脂肪酶催化生物合成的研究进展
• 第一章 有机介质中辣椒素酯的酶促合成条件
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试剂
• 1.1.2 仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 部分原料的制备
• 1.2.1.1 反应溶剂预处理
• 1.2.1.2 原料前处理
• 1.2.1.3 壬酸甲酯的制备
• 1.2.2 壬酸香草醇酯的酶促催化合成反应条件
• 1.2.2.1 反应体系的建立
• 1.2.2.2 影响酶催化反应的单因素条件实验
• 1.2.2.3 酶催化反应影响因素的正交实验
• 1.2.3 产物的定性与定量分析方法
• 1.2.3.1 TLC检测条件
• 1.2.3.2 HPLC分析条件
• 1.2.3.3 GC分析条件
• 2 结果与分析
• 2.1 壬酸甲酯的制备
• 2.2 脂肪酶催化合成的条件实验
• 2.2.1 脂肪酶的选择
• 2.2.2 有机溶剂的选择
• 2.2.3 酶量的选择
• 2.2.4 底物摩尔比对反应的影响
• 2.2.5 溶剂水含量对反应的影响
• 2.2.6 温度对反应的影响
• 2.2.7 酰基供体对反应的影响
• 2.2.8 酰基供体酰基链长对酶促转酯反应的影响
• 2.3 反应条件的优化
• 2.4 酶的重复利用
• 3 小结
• 第二章 天然辣椒素酯的酶催化合成与表征
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 仪器
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 天然辣椒素脂肪酰基甲酯的制备
• 1.3.2 壬酸香草醇酯的酶催化合成
• 1.3.3 定性与定量分析方法
• 1.3.3.1 TLC条件
• 1.3.3.2 HPLC条件
• 1.3.3.3 GC条件
• 2 结果与分析
• 2.1 天然辣椒素脂肪酰基甲酯的制备
• 2.2 壬酸香草醇酯的合成与表征
• 2.3 天然辣椒素酯的酶促合成与表征
• 2.3.1 天然辣椒素酯的酶促合成与分离纯化
• 2.3.2 天然辣椒素酯与天然辣椒素的HPLC谱图比较分析
• 2.3.3 直接进样MS谱图分析
• 2.3.4 GC-MS谱图分析
• 3 小结
• 第三章 有机介质中酶促反应动力学研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 仪器
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 实验过程
• 1.3.2 反应初速率的测定
• 1.3.3 反应动力学常数的测定
• 1.4 分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 反应机理与动力学模型
• 2.2 反应模型
• 2.3 动力学常数的求取
• 2.3.1 底物浓度对反应初速度的影响
• 2.3.2 动力学常数的求取
• 3 小结
• 符号说明
• 第四章 发酵法制备脂肪酶及其催化活性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 仪器
• 1.1.4 培养基
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 生长曲线的制作
• 1.2.2 发酵产酶
• 1.2.3 粗酶液的制备
• 1.2.4 酶的固定化
• 1.3 酶促反应
• 1.3.1 反应溶剂预处理
• 1.3.2 酶促反应体系
• 1.4 分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 生长曲线
• 2.2 粗酶液的制备
• 2.3 酶的固定化与催化活力
• 3 小结
• 第五章 全文总结
• 1 总结
• 2 今后进一步研究设想
• 3 结论
• 4 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历