本文主要研究内容
作者冯茹（2019）在《与猪瘟病毒NS5B蛋白互作的宿主蛋白galectin-1对猪瘟病毒复制的影响》一文中研究指出：猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种猪的流行性疾病。该病的典型临床症状为高热,组织器官出血、阻塞和坏死,周身多发性小出血点,繁殖障碍等。CSFV是一种单股正链RNA病毒,NS5B蛋白是CSFV的非结构蛋白,它具有依赖于RNA的RNA聚合酶活性(RNA dependent RNA polymerase,RdRp),在病毒复制的过程中发挥重要作用。研究NS5B蛋白和宿主细胞蛋白之间的相互作用,可以为了解CSFV的感染,认识NS5B蛋白在其感染过程中发挥的作用提供有效工具。在实验室前期的研究中,用含有CSFV NS5B基因构建的诱饵质粒与猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAM)cDNA文库进行酵母双杂交,成功筛选到了与CSFV NS5B蛋白相互作用的半乳糖凝集素-1(Lectin galactoside-binding soluble 1,LGALS 1/galectin-1)。galectin-1在细胞内和细胞外都具有很多功能,比如在机体内诱导细胞凋亡,通过调节炎症发生及免疫反应等来抵御外界病原微生物的入侵,还可以影响肿瘤的发生、细胞的黏附、细胞之间信号的转导等。galectin-1可以通过与蛋白或多糖之间相互影响来发挥其功能。本研究通过将CSFV NS5B基因片段克隆含有冷启动子的pCold-SUMO原核表达载体构建了重组质粒,转化Rosetta(DE3)大肠杆菌表达菌,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,成功地将重组蛋白在上清中表达。采用镍柱亲和层析法(NiNTA)进行纯化以获得纯度较高的蛋白,纯化得到的蛋白免疫小鼠以制备抗NS5B的多克隆抗体,通过蛋白免疫印迹(Western blot)验证所制备多克隆抗体的反应性和特异性。发现制备的多克隆抗体可以与原核表达及真核质粒转染瞬时表达的NS5B蛋白发生反应,即通过Western blot可以检测到特异性条带,但与CSFV感染PK-15细胞后裂解所得的天然构象的NS5B蛋白不能发生特异性反应。研究发现CSFV感染的宿主细胞中galectin-1在转录水平(mRNA)和蛋白水平均出现下调。通过分别构建了galectin-1过表达和干扰稳定转染细胞系,接种CSFV后利用实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)对CSFV的转录水平及释放到上清中的病毒滴度水平进行检测。发现干扰PK-15细胞中galectin-1基因的表达可以上调CSFV的转录,过表达galectin-1蛋白下调了CSFV的转录和上清中的病毒滴度,即galectin-1具有抑制CSFV复制的生物学活性,可以为以后研发抗CSFV药物提供新的理论依据。
Abstract
zhu wen (Classical swine fever,CSF)shi you zhu wen bing du (Classical swine fever virus,CSFV)yin qi de yi chong zhu de liu hang xing ji bing 。gai bing de dian xing lin chuang zheng zhuang wei gao re ,zu zhi qi guan chu xie 、zu sai he huai si ,zhou shen duo fa xing xiao chu xie dian ,fan shi zhang ai deng 。CSFVshi yi chong chan gu zheng lian RNAbing du ,NS5Bdan bai shi CSFVde fei jie gou dan bai ,ta ju you yi lai yu RNAde RNAju ge mei huo xing (RNA dependent RNA polymerase,RdRp),zai bing du fu zhi de guo cheng zhong fa hui chong yao zuo yong 。yan jiu NS5Bdan bai he su zhu xi bao dan bai zhi jian de xiang hu zuo yong ,ke yi wei le jie CSFVde gan ran ,ren shi NS5Bdan bai zai ji gan ran guo cheng zhong fa hui de zuo yong di gong you xiao gong ju 。zai shi yan shi qian ji de yan jiu zhong ,yong han you CSFV NS5Bji yin gou jian de you er zhi li yu zhu fei pao ju shi xi bao (Porcine alveolar macrophages,PAM)cDNAwen ku jin hang jiao mu shuang za jiao ,cheng gong shai shua dao le yu CSFV NS5Bdan bai xiang hu zuo yong de ban ru tang ning ji su -1(Lectin galactoside-binding soluble 1,LGALS 1/galectin-1)。galectin-1zai xi bao nei he xi bao wai dou ju you hen duo gong neng ,bi ru zai ji ti nei you dao xi bao diao wang ,tong guo diao jie yan zheng fa sheng ji mian yi fan ying deng lai di yu wai jie bing yuan wei sheng wu de ru qin ,hai ke yi ying xiang zhong liu de fa sheng 、xi bao de nian fu 、xi bao zhi jian xin hao de zhuai dao deng 。galectin-1ke yi tong guo yu dan bai huo duo tang zhi jian xiang hu ying xiang lai fa hui ji gong neng 。ben yan jiu tong guo jiang CSFV NS5Bji yin pian duan ke long han you leng qi dong zi de pCold-SUMOyuan he biao da zai ti gou jian le chong zu zhi li ,zhuai hua Rosetta(DE3)da chang gan jun biao da jun ,li yong yi bing ji -β-D-liu dai ban ru tang gan (IPTG)you dao biao da ,cheng gong de jiang chong zu dan bai zai shang qing zhong biao da 。cai yong nie zhu qin he ceng xi fa (NiNTA)jin hang chun hua yi huo de chun du jiao gao de dan bai ,chun hua de dao de dan bai mian yi xiao shu yi zhi bei kang NS5Bde duo ke long kang ti ,tong guo dan bai mian yi yin ji (Western blot)yan zheng suo zhi bei duo ke long kang ti de fan ying xing he te yi xing 。fa xian zhi bei de duo ke long kang ti ke yi yu yuan he biao da ji zhen he zhi li zhuai ran shun shi biao da de NS5Bdan bai fa sheng fan ying ,ji tong guo Western blotke yi jian ce dao te yi xing tiao dai ,dan yu CSFVgan ran PK-15xi bao hou lie jie suo de de tian ran gou xiang de NS5Bdan bai bu neng fa sheng te yi xing fan ying 。yan jiu fa xian CSFVgan ran de su zhu xi bao zhong galectin-1zai zhuai lu shui ping (mRNA)he dan bai shui ping jun chu xian xia diao 。tong guo fen bie gou jian le galectin-1guo biao da he gan rao wen ding zhuai ran xi bao ji ,jie chong CSFVhou li yong shi shi ying guang ding liang PCRji shu (Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)he jian jie mian yi ying guang shi yan (Indirect immunofluorescence assay,IFA)dui CSFVde zhuai lu shui ping ji shi fang dao shang qing zhong de bing du di du shui ping jin hang jian ce 。fa xian gan rao PK-15xi bao zhong galectin-1ji yin de biao da ke yi shang diao CSFVde zhuai lu ,guo biao da galectin-1dan bai xia diao le CSFVde zhuai lu he shang qing zhong de bing du di du ,ji galectin-1ju you yi zhi CSFVfu zhi de sheng wu xue huo xing ,ke yi wei yi hou yan fa kang CSFVyao wu di gong xin de li lun yi ju 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自西北农林科技大学的冯茹，发表于刊物西北农林科技大学2019-07-11论文，是一篇关于猪瘟病毒论文,蛋白论文,多克隆抗体论文,西北农林科技大学2019-07-11论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自西北农林科技大学2019-07-11论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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