云锦杜鹃菌根及其菌根真菌多样性研究

论文摘要

杜鹃花科（Ericaceae）大多数植物的根系在自然生境中形成一种特殊类型的内生菌根共生体,即杜鹃花类菌根（也称为欧石南类菌根）（Ericoid mycorrhizas,ERM）.ERM对于改善植物营养吸收、增强对重金属离子的抗性、缓解环境因子的胁迫等方面具有重要的作用。人工接种ERM真菌对某些杜鹃花科植物的生长有明显促进作用。为了发掘和利用菌根的潜能,满足生态建设和园艺生产的需要,国际园艺学界对ERM进行了相关研究,特别是近年来这一问题受到广泛关注。我国杜鹃花科植物分布广泛,但对ERM研究几乎空白,尚未见到相关正式报道。云锦杜鹃（Rhododendron fortuneiL.）是原产我国的杜鹃花科杜鹃花属大叶常绿杜鹃花种类之一,观赏价值高且抗逆性突出,为珍贵的育种资源,因而在国际园艺史上占有重要地位。但是以该植物为代表的大叶常绿杜鹃花的引种栽培,一直是困扰我国园林园艺界的难题。本研究以云锦杜鹃为试验材料首次对我国ERM及其菌根真菌多样性进行分析,获得了大量的ERM真菌资源和显著的幼苗接种效应,将对推动我国ERM的研究、菌根技术在园林中的应用及杜鹃花引种栽培和繁育等技术问题的解决具有重要的意义。论文通过对云锦杜鹃菌根显微结构、分离真菌的形态及其遗传多样性、接种效应等方面的探索性研究,获得了以下主要结论:1.利用扫描电镜、锥虫兰染色压片和树脂半超薄切片法首次对自然生境中云锦杜鹃的毛根菌根侵染率和显微结构进行研究。结果显示:毛根表面不形成根毛结构,而是包裹着一层或致密或疏松的菌丝。菌根真菌的侵染一般发生在营养根和生长根的成熟根段,总侵染率比较高,都在65%以上。菌根与毛根解剖结构类似,由1层表皮细胞、1-2层皮层细胞和狭小中柱组成,表皮细胞内具有典型的ERM菌丝体结构。云锦杜鹃菌根90%以上含有菌丝体的表皮细胞壁加厚不明显。菌根表皮细胞内有两类形态差异明显的菌丝复合体:一类为粗菌丝形成紧密菌丝圈和另一类为细菌丝形成松散菌丝圈。2.作者对Pearson & Read（1973）建立的杜鹃花科植物根系内生真菌分离技术进行了优化,首次改良马丁氏培养基并成功应用于ERM真菌的分离,提高了真菌分离的效率。试验从4个云锦杜鹃自然分布地的根系中分离了280个菌株,开始了我国ERM真菌资源多样性的研究。通过对菌落形态、菌丝体显微特征、rDNA-ITS片段的RFLP图谱分析,把280个菌株分为17个类型（14个RFLP类型和3个未能进行分子鉴定的类型）。根据rDNA-ITS序列比对和Bootstrap检验结果:云锦杜鹃菌根分离真菌的主体仍是子囊菌,其rDNA-ITS序列与已知分离菌株序列相似性为89%—99%,14个RFLP类型中,有7个类型（即50%的类型）与现已经发现的杜鹃花类菌根真菌亲缘关系密切,分别为Oidiodendron maius Barron、Cryptosporiopsis ericae Siglersp.nov和5种Epacrid root endophyte同源或近缘种;2个类型为黑色有隔内生菌类（Dark Septate Root Endophytes,DSE）,即Phialocephala类菌株;3个为未知类型的子囊菌类,1个为枝状枝孢霉类,1为未知菌种类型。研究还发现:同一地带的4个云锦杜鹃群落菌根分离真菌都具有丰富的多样性,大部分菌种类型在不同样地间具有一致性,70%以上的菌株类型为2个以上的样地共有;但不同样地的菌株类型也表现了明显的趋异性,华顶山和幕阜山森林公园主导菌株为Phialocephala fortinii wang &Wilcox类,而四明山森林公园和黄山风景区为Oidiodendron maius Barron类菌株。3.将分离到的真菌菌落接种云锦杜鹃幼苗,锥虫兰染色压片镜检幼苗毛根内是否具有ERM菌丝体,作为初步判断ERM真菌的标准。结果显示:17个菌株类型中,9个类型33个菌株接种苗毛根内检测到ERM结构,8个类型没有观察到ERM结构。初步确定9个菌株类型为ERM真菌,其中5个类型为其他ERM植物的菌根真菌同源或近缘类型,分别为Oidiodendron maius Barron及4个不同的Epacris root associatedfungus类菌株,2个类型,即Cladosporium cladosporioides和Fungal sp.R27近缘菌株,为本研究首次分离的新ERM真菌类型,Cryptosporiopsis ericae Sigler sp.nov1和Phialocephala fluminis Shearer,JL Crane & MA Mill.近缘类型是2个首次合成ERM的菌株类型。4.研究首次对多种类型的ERM菌株的接种效应进行研究。通过14个类型的菌株接种效应的统计分析表明:不论是否为ERM真菌菌株,绝大多数对接种幼苗的生长没有伤害作用;对云锦杜鹃接种幼苗具有明显促进作用的菌株都是确认的ERM真菌,其中大部分为其他ERM植物分离菌根真菌的同源种或近缘种。其中首次发现5个类型（3个Epacris root associated fungus、C.ericae、Fungal sp.R27的近缘菌株）的菌株能显著地增加接种幼苗的生物量。不同类型ERM菌株或同一类型不同菌株在接种效应上差异很大,接种苗干重的增加率多在20-250%之间,最高可达400%。5个ERM菌株在不同氮源培养基上纯培养和幼苗接种试验表明:不同的ERM菌株能够吸收单一有机氮源,并且能帮助寄主氮营养的吸收从而促进幼苗生物量的增加。菌株在不同氮源培养基上接种效应差异显著,5个菌株接种苗在有机氮BSA、精氨酸培养基上生物量增加显著高于氨态氮和对照培养基上的幼苗。以上研究结果表明:菌根在云锦杜鹃的生长发育中占有重要地位,菌根的形成对其幼苗的生长具有关键作用。接种菌根真菌,实现幼苗的早期菌根化,有希望成为解决大叶常绿杜鹃花繁育中幼苗生长缓慢、死亡率高等问题的一个良策。研究获得的菌种资源和技术方法,为优良菌剂的研制及菌根技术的应用奠定了基础,同时为探索植物与真菌之间的共生机制建立了良好的模式。因此,本研究实践价值和科学意义深远。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 1.引言
• 1.1 菌根研究进展
• 1.1.1 菌根研究历史
• 1.1.2 菌根形态多样性
• 1.1.3 菌根真菌的物种多样性
• 1.1.4 菌根功能的多样性
• 1.1.5 菌根接种技术的应用
• 1.1.5.1 提高植物引种的成功率
• 1.1.5.2 提高植物抗性,加速植被重建
• 1.1.5.3 防治植物根部病害
• 1.1.5.4 辅助植物育苗,提高育苗的效率和质量
• 1.1.6 菌根研究存在的问题与发展方向
• 1.2 杜鹃花类菌根研究进展
• 1.2.1 杜鹃花类菌根的解剖结构与侵染特征
• 1.2.2 杜鹃花类菌根真菌物种与遗传多样性研究
• 1.2.3 菌根营养特性的多样性
• 1.2.4 菌根抗重金属污染能力的多样性
• 1.2.5 菌根对植物生长效应
• 1.2.6 杜鹃花类菌根研究存在问题与研究方向
• 1.2.6.1 杜鹃花类菌根真菌遗传多样性
• 1.2.6.2 菌根功能及效应多样性研究
• 1.2.6.3 我国的研究现状
• 1.3 菌根生物多样性
• 1.3.1 生物多样性的基本概念
• 1.3.2 菌根生物多样性
• 1.4 分子生物学技术在菌根真菌鉴定和遗传多样性研究中的应用
• 1.4.1 菌根真菌研究中应用的分子生物学技术比较
• 1.4.2 rDNA的特点及其在真菌多样性研究中的优势
• 1.4.3 基于rDNA内转录间隔区（ITS）分子生物学技术的应用
• 1.4.3.1 ITS区段的长度（分子量）标记
• 1.4.3.2 ITS区段的RFLP图谱
• 1.4.3.3 用特异性引物扩增ITS区段
• 1.4.3.4 rDNA序列分析
• 1.5 云锦杜鹃（Rhododendron fortunei Lindl.）及其相关研究进展
• 1.5.1 云锦杜鹃的应用价值
• 1.5.2 云锦杜鹃在我国的分布
• 1.5.3 云锦杜鹃相关研究进展
• 1.5.4 云锦杜鹃研究与应用中存在的问题
• 2.研究思路与研究方法
• 2.1 研究背景
• 2.2 研究思路
• 2.3 主要研究内容
• 2.4 研究方法及技术路线
• 2.4.1 采样点的基本情况
• 2.4.2 研究方法
• 2.4.2.1 菌根侵染状况及解剖结构观察
• 2.4.2.2 菌根分离培养
• 2.4.2.3 菌根物种真菌多样性研究
• 2.4.2.4 菌根真菌接种效应研究
• 2.4.2 研究技术路线
• 3.云锦杜鹃菌根侵染率及结构多样性研究
• 3.1 试验材料与方法
• 3.1.1 植物材料来源
• 3.1.2 压片与切片制作方法
• 3.1.3 菌根侵染率及侵染强度估测方法
• 3.1.4 使用试剂
• 3.2 试验结果
• 3.2.1 菌根侵染率
• 3.2.2 毛根形态差异
• 3.2.3 菌根的结构
• 3.2.4 菌根真菌在毛根中的分布
• 3.2.5 菌根表皮细胞内菌丝体形态
• 3.3 结果分析与讨论
• 3.3.1 云锦杜鹃菌根结构
• 3.3.2 云锦杜鹃菌根细胞壁加厚现象
• 3.3.3 云锦杜鹃菌根内菌丝体形态多样性
• 3.4 小结
• 3.4.1 自然生境中云锦杜鹃菌根侵染率
• 3.4.2 云锦杜鹃菌根的形态与解剖结构
• 3.4.3 菌根内菌丝的形态差异
• 4.云锦杜鹃菌根分离真菌物种多样性研究
• 4.1 根系菌根真菌的分离技术研究
• 4.1.1 材料与方法
• 4.1.1.1 试验材料
• 4.1.1.2 试验方法
• 4.1.2 结果与分析
• 4.1.2.1 分离菌株的特征与类别
• 4.1.2.2 分离菌落回接试验结果
• 4.1.3 结论与讨论
• 4.2 云锦杜鹃菌根分离真菌物种多样性研究
• 4.2.1 分离真菌形态多样性
• 4.2.1.1.材料和方法
• 4.2.1.2 结果与分析
• 4.2.2 分离菌根真菌的遗传多样性研究
• 4.2.2.1 材料和方法
• 4.2.2.2 研究结果与分析
• 4.2.3 结论与讨论
• 4.2.3.1 云锦杜鹃菌根的分离真菌多样性
• 4.2.3.2 不同分布地的云锦杜鹃根系内生菌的差异
• 4.3 小结
• 4.3.1 杜鹃花类根系内生真菌分离技术
• 4.3.2 云锦杜鹃根系内生真菌多样性
• 4.3.3 不同分布地云锦杜鹃根系内生真菌多样性
• 5.云锦杜鹃菌根分离真菌接种效应多样性研究
• 5.1 分离真菌侵染能力及接种效应研究
• 5.1.1 试验材料和方法
• 5.1.1.1 试验材料
• 5.1.1.2 试验方法
• 5.1.2 结果与分析
• 5.1.2.1 不同类型菌株侵染能力检测
• 5.1.2.2 不同菌株对云锦杜鹃幼苗生长量的影响
• 5.1.3 结论和讨论
• 5.1.3.1 不同类型菌株侵染能力的差异
• 5.1.3.2 不同类型菌株功能多样性
• 5.2 几种分离ERM真菌对氮源的利用
• 5.2.1 试验材料与方法
• 5.2.1.1 试验材料
• 5.2.1.2 试验方法
• 5.2.2 结果与分析
• 5.2.2.1 不同N源对云锦杜鹃接种苗侵染率的影响
• 5.2.2.2 菌株对不同氮源的利用
• 5.2.2.3 云锦杜鹃接种苗在不同氮源培养基上的生物量
• 5.2.3 结论与讨论
• 5.2.3.1 ERM菌株氮源利用能力的差异
• 5.2.3.2 不同ERM菌株接种苗在各种氮源培养基上生物量差异
• 5.3 小结
• 6.结论
• 6.1 主要结论
• 6.2 ERM真菌辅助杜鹃花繁育及栽培的前景探讨
• 参考文献
• 个人简介
• 近三年发表论文
• 导师简介
• 致谢