论文摘要
研究背景炎症因子对心肌细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的重构有重要的病理生理学作用。在调节ECM降解和合成中,基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMPs）是主要的酶类。心肌组织中MMP-2是最为广泛分布的MMP,MMP-2组织抑制剂（type 2 tissue inhibitor of matrixmetalloproteinases,TIMP-2）是MMP-2的内源性抑制剂,与MMP-2一起参与调节ECM的动态平衡。现有资料表明小鼠MMP-2、MMP-9基因敲除后,明显延缓了左室重构,心肌失代偿和心力衰竭的进展。白介素-1β（interleukin—1β,IL-1β）是心力衰竭中主要的炎症因子,它可影响心脏成纤维细胞血管紧张素受体1A的表达;诱导MMP-9、MMP-2的表达和活性增高,参与ECM的重构。一氧化氮（nitric oxide,NO）是体内重要的细胞内信号分子,它的合成受一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）的调控。其中诱导型NOS（inducible NOS,iNOS）在正常情况下不表达,内毒素或炎症因子刺激时可被迅速诱导,促进NO的大量生成,从而诱发各种病理生理过程,其中包括促进心脏成纤维细胞MMP-2合成和活性增加。研究表明心脏成纤维细胞iNOS-NO系统也是IL-1β作用的靶点,但目前对于IL-1β是否能通过iNOS-NO系统影响心脏成纤维细胞MMPs以及TIMPs的表达还无相关报道。血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin-converting enzyme inhibitor,ACEI）是治疗慢性心力衰竭的基石药物,它具有明显的抗心肌重构作用,但详细机制仍有待进一步揭示。在盐敏感的Dah1大鼠上发现ACEI能抑制心肌iNOS的表达,延缓心肌重构进程和心力衰竭的发生,同样在自发性大鼠模型上ACEI减轻了MMPs的基因表达和活性增高,并缩小了左室内径。上述ACEI的抗心肌重构作用显然有别于传统机制,即通过阻滞组织和循环血管紧张素Ⅱ生成,抑制缓激肽降解发挥抗心肌重构作用,但目前对此机理研究鲜有报道。针对上述问题本研究拟探索炎症因子IL-1β是否能通过iNOS-NO系统影响心脏成纤维细胞MMPs/TIMPs的平衡;ACEI是否对心脏成纤维细胞MMPs/TIMP-2的失衡有纠正作用。目的（1）观察IL-1β对人心脏成纤维细胞MMP-2、MMP-9、TIMP-2的作用及相关机理;（2）观察ACEI制剂咪达普利拉（imidaprilat）对心脏成纤维细胞MMP-2、MMP-9和TIMP-2的影响及可能机理;（3）观察咪达普利拉对IL-1β诱导地心脏成纤维细胞MMP-2、MMP-9和TIMP-2的影响及可能机理。方法细胞培养将人心脏成纤维细胞以5×104/孔的密度接种于6孔培养板内,待实验选用的3-6代细胞群80-90%融合后用无血清完全培养基（CS-C medium,CSM）继续培养,24h后用PBS洗涤细胞2次并接受各种干预措施。RT-PCR待实验细胞接受干预12h后,提取细胞总RNA进行逆转录。根据基因库内GAPDH、MMP-2、TIMP-2、MMP-9基因全序列设计相应引物,进行PCR扩增。以特异性MMP-2、MMP-9和TIMP-2扩增条带灰度与对应GAPDH扩增条带灰度比值对mRNA表达量进行半定量分析。酶谱分析细胞约80-90%融合并用CSM孵育24h后,接受含IL-1β（1ng/ml～10ng/ml）和/或咪达普利拉(10-9M～10-6M)的CSM继续孵育24h。完成各种干预后,收集培养上清。通过凝胶酶谱进行MMP-2、MMP-9的活性检测,上样量通过对应细胞蛋白含量进行标化。MMPs显示为位于蓝色背景上的透亮带,采用条带密度分析仪进行图像分析并测定吸光度值。NO测定采用Griess法测定样品中的亚硝基（nitrite,NO2）含量来衡量细胞上清中NO水平。取培养上清100μl与等量的Griess试剂（Griess试剂A和Griess试剂B各一份）,室温反应10分钟后,用酶联仪测A540nm波长下吸光度值。用NANO2作标准曲线。Western blot细胞接受各种刺激24h后,收集细胞总蛋白,采用Western blot法测定细胞iNOS蛋白的表达,用条带密度分析仪进行图像分析并测定吸光度值。数据分析每组实验重复4次。数据以均数±标准差表示。利用SPSS 11.5软件处理数据,多组间均数的比较采用方差分析,有显著差异者用LSD检验。两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。结果1.通过凝胶酶谱分析表明人心脏成纤维细胞能分泌MMP-2,但我们的实验系统难以发现心脏成纤维细胞MMP-9的分泌。通过RT-PCR检测到MMP-2、TIMP-2的mRNA表达,但试用各种循环参数也难以发现MMP-9的mRNA表达,而同样的引物能在阳性对照（人巨噬细胞）上发现MMP-9的mRNA表达。2.人心脏成纤维细胞接受IL-1β刺激24h后,酶谱分析结果表明IL-1β促进了细胞MMP-2的活性增加,4ng/ml的IL-1β刺激作用达到高峰,与对照组相比活性增加了170.24±13.12%（P＜0.01）,而10ng/ml IL-1β刺激组与4ng/mlIL-1β刺激组相比,两者间MMP-2活性无明显差异（P＞0.05）。3.IL-1β干预心脏成纤维细胞12h后,通过RT-PCR结果表明:与正常对照组相比,4ng/ml IL-1β组MMP-2 mRNA表达明显增加（P＜0.01）;10ng/ml IL-1β组MMP-2 mRNA表达与4ng/ml IL-1β组MMP-2 mRNA表达相比无明显差异（P＞0.05）。4.心脏成纤维细胞接受IL-1β刺激24h后,通过酶谱分析结果表明IL-1β时间依赖性地促进心脏成纤维细胞MMP-2的活性增加,刺激24h作用达到高峰,与对照组相比有显著统计学差异（P＜0.01）。5.心脏成纤维细胞接受IL-1β刺激24h后,提取其上清,通过Griess法检测表明IL-1β（4ng/ml）可以明显促进细胞NO水平升高（P＜0.01）,而iNOS抑制剂NG-甲基—L-精氨酸(NG-methyl L-Arginine,L-NMMA,10-3M)显著抑制了IL-1β诱导的MMP-2 mRNA表达（P＜0.01）、MMP-2活性（P＜0.01）以及NO的升高（P＜0.01）。通过Westen blot发现在生理水平的心脏成纤维细胞上未能检测到iNOS蛋白的表达,而不同浓度的IL-1β明显促进细胞iNOS的蛋白合成。6.通过酶谱分析和RT-PCR结果表明咪达普利拉在实验所选浓度范围内对心脏成纤维细胞MMP-2的活性（P＞0.05）和mRNA表达（P＞0.05）无明显影响。7.心脏成纤维细胞接受咪达普利拉(10-9～10-6M)和IL-1β（4ng/ml）联合作用后,通过酶谱分析结果表明咪达普利拉可以浓度依赖性地抑制IL-1β诱导地细胞MMP-2的活性增高（P＜0.01）。8.心脏成纤维细胞在咪达普利拉(10-7M)和IL-1β（4ng/ml）联合作用后,通过Griess法发现咪达普利拉抑制了IL-1β诱导地细胞上清NO水平的上升（P＜0.01）,通过Westen blot发现咪达普利拉抑制了IL-1β诱导地细胞iNOS蛋白的增加（P＜0.01）;而SNP顿挫了咪达普利拉的作用,包括对IL-1β诱导地MMP-2 mRNA表达（P＜0.01）、MMP-2活性（P＜0.01）的抑制和对IL-1β诱导地iNOS蛋白表达的抑制（P＜0.01）。9.心脏成纤维细胞接受IL-1β（4ng/ml）和咪达普利拉(10-7M)刺激12h后,通过RT-PCR发现它们对细胞TIMP-2 mRNA表达无明显影响（P＞0.05）。10.通过体外鳌合实验发现咪达普利拉(10-7M,主要实验浓度)未能通过对鳌合作用竞争性抑制MMP-2的活性（P＞0.05）,而EDTA明显抑制MMP-2的活性（P＜0.01）。结论（1）IL-1β能促进心脏成纤维细胞MMP-2的mRNA表达和MMP-2活性增加,并提示其作用与细胞iNOS-NO水平相关。（2）咪达普利拉对未受干预的心脏成纤维细胞MMP-2 mRNA表达和活性无明显影响,但它能抑制IL-1β诱导地心脏成纤维细胞MMP-2 mRNA表达和活性的增加,其机理可能咪达普利拉抑制了IL-1β诱导地心脏成纤维细胞iNOS蛋白的合成以及NO水平升高,进而影响MMP-2表达与活性。（3）IL-1β和咪达普利拉对心脏成纤维细胞TIMP-2 mRNA表达无明显作用。
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标签：心脏成纤维细胞论文; 白介素论文; 一氧化氮论文; 基质金属蛋白酶论文; 血管紧张素转化酶抑制剂论文;