蛋白磷酸酶2A Cα亚基敲除所致心脏能量代谢重塑的研究

论文摘要

在蛋白质的翻译后修饰中,可逆磷酸化的调节需要激酶和磷酸酶的参与。其中,PP2A是一种受到广泛关注的蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。其进化上较保守,组织分布广泛。其全酶是一类异源三聚体蛋白,由结构亚基A、调节亚基B、和催化亚基C组成。由于Ca是主要的催化亚基亚型,缺乏Ca的PP2A基本丧失了全酶的催化活性。PP2A Ca心脏特异性敲除小鼠系一种幼年期发生心肌肥厚、心力衰竭的新型动物模型。前期的研究发现,该小鼠生后8天起出现心肌肥厚,在12-14天因充血性心力衰竭而死亡；透射电镜显微术观察敲除组动物心肌细胞超微结构显示其肌纤维排列紊乱,线粒体形态大小及数目异常。值得注意的是：PP2A Ca心脏特异性敲除小鼠从基因敲除到发展为心肌肥厚乃至心衰的过程仅仅发生在数天以内。在这一时期,动物正处于心脏组织快速生长、心肌能量代谢从胚胎转向成熟的发育阶段,这时心脏代谢底物从乳酸和葡萄糖逐渐转向脂肪酸。而一般病理状态下,若动物罹患病理性心肌肥厚并向心衰发展时,心脏倾向于重新通过具有更高O2利用率的糖酵解提供能量。根据我们的实验结果,（1）当PP2A Ca表达降低时,一系列能量代谢相关的基因的mRNA表达水平发生了改变。Cpt-1α、Cpt-1β、Cpt-2和CD36等脂肪酸运输相关蛋白显著下调；而对于脂肪酸β氧化中涉及的一些关键酶,MCAD和Echl显著下调；糖酵解相关的ENO1α、LDHA、HK2显著地下调；与线粒体生成有关的TFAM、POLG和POLG2表现出下降的趋势；线粒体电子传递链中的Ndufa2、Ndufa8、Cycs、Cox7a2、Cox4il及协助生成ATP的ATP5i亦表现出下调的趋势,说明线粒体功能受到严重的影响。JC-1染色检测心室肌细胞线粒体膜电位下降,验证了这一点。然而据报道能在转录水平影响心肌细胞能量代谢的三种关键基因PPARα、PGC-1α和c-Myc的：mRNA表达水平并未发生显著变化。有趣的是,十种c-Myc下游靶基因（CD36、ENO1a、LDHA、HK2、TFAM、Ndufa2、Cycs、Cox7a2、CyclinD1、PCNA）的mRNA表达显著下调,提示c-Myc可能是该动物模型心脏能量代谢重塑的关键因素。（2）通过与另外两种心肌肥厚模型（Hsp27心肌特异性过表达和RHAU心肌特异性敲除小鼠模型）进行比较,我们确认了心脏病理性恶化中普遍存在能量代谢重构这一现象。（3）通过免疫共沉淀技术直接证明了PP2A Ca与c-Myc之间具有物理结合。然而据文献报道,受PP2A调控,并可能对c-Myc的蛋白丰度有所影响的β-catenin及c-Myc的第62位丝氨酸磷酸化水平均未发生变化,但通过对c-Myc的亚细胞分布的研究,发现c-Myc在细胞核内的分布显著减少,提示PP2A Ca的敲除可能通过改变c-Myc在细胞中的分布影响了c-Myc的功能。（4）最后,通过构建针对PP2A Ca设计的慢病毒shRNA侵染NRVM体外研究模型,实现对动物敲除模型的补充,以减少体内神经体液调节所产生的干扰。综上所述,PP2A Cα敲除可致小鼠心脏快速地发生能量代谢的重构现象。尽管研究模型中的心脏处于特殊的发育时期,但能量代谢的重塑是伴随着心脏功能的重构发生的一种普遍现象。考虑到c-Myc的下游靶基因在这一重塑过程中的明显变化,我们又对PP2A Ca与c-Myc之间的相互关系进行了系统的研究,并初步得出了"PP2A Cα通过影响c-Myc的亚细胞分布对其功能产生影响”这一结论。这对日后进一步研究PP2A Cα对c-Myc进行调控的分子机制的研究具有一定的指导意义。

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Abstract

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第一章蛋白磷酸酶2A C α亚基敲除所致心脏能量代谢重塑的研究

1.1 前言

1.2 材料与方法

1.2.1 实验动物

1.2.2 试剂和耗材

1.2.3 主要仪器

1.2.4. 实验方法

1.2.4.1 小鼠基因型鉴定

1.2.4.2 小鼠左心室总RNA提取及实时荧光定量PCR检测

1.2.4.3 小鼠左心室肌细胞分离

1.2.4.4 蛋白质的提取

1.2.4.5 免疫印迹法（Westernblot）检测蛋白的相对表达量

1.2.4.6 免疫共沉淀

1.2.4.7 染色质免疫共沉淀

1.2.4.8 免疫细胞化学

1.2.4.9 线粒体跨膜电位的测定

1.2.4.10 分离和培养原代新生大鼠心室肌细胞

1.2.4.11 筛选shRNA并包装成慢病毒颗粒侵染新生大鼠心室肌细胞

1.2.4.12 数据处理和统计

1.3 实验结果

第一节 PP2A C α心脏特异性敲除小鼠心室肌细胞能量代谢模式改变的研究

1 新生小鼠基因型的鉴定

2 PP2A催化亚基C α在出生后第11天蛋白水平和mRNA水平表达量的变化

3 PP2A C α心脏特异性敲除小鼠心室肌细胞中能量代谢模式的改变

4 本节小结

第二节三种不同的心肌肥厚模型能量代谢相关基因mRNA水平的变化对比

1 三种不同方式引起小鼠心肌肥厚

2 心肌肥厚动物模型中心肌能量代谢相关基因mRNA的表达模式

3 心肌肥厚动物模型中转录因子及其下游基因mRNA的表达模式

4 本节小结

第三节 PP2A与转录因子c-Myc

1 PP2A C α与转录因子c-Myc具有直接的物理结合

2 PP2A C α心脏特异性敲除小鼠心室肌细胞中转录因子c-Myc蛋白水平及第62位丝氨酸磷酸化水平的变化

3 PP2A C α心脏特异性敲除小鼠心室肌细胞中c-Myc功能的变化

4 与c-Myc功能有关的细胞增殖相关基因mRNA水平的变化

5 PP2A C α心脏特异性敲除小鼠心室肌细胞中c-Myc的亚细胞分布变化

6 对c-Myc蛋白序列进行分析预测其与核定位有关的蛋白磷酸化位点

7 本节小结

第四节通过RNA干扰技术敲减PP2A C α体外研究模型的建立

1 慢病毒侵染原代大鼠心室肌细胞

2 慢病毒介导的RNA干扰所致PP2A C α蛋白表达水平的变化

3 PP2A C α细胞水平敲减后心肌肥厚标记基因mRNA水平的变化

4 本节小结

1.4 讨论

1.5 全文总结

1.6 展望

第二章综述健康与衰竭时心脏的能量代谢

导言

健康心脏的能量代谢

糖代谢

脂代谢

酮体代谢

心肌能量代谢的转录调节

不同发育阶段的心肌能量代谢

心衰时的底物代谢

心衰时的线粒体功能

心衰时的代谢基因调控

小结

第三章参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢

蛋白磷酸酶2A Cα亚基敲除所致心脏能量代谢重塑的研究

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