论文摘要
研究背景随着冠状动脉介入术及冠脉搭桥术等治疗手段的广泛应用,继之出现的心肌细胞再灌注损伤日益受到心脏病学家的高度重视。除应用各种药物和基因治疗手段抑制和预防再灌注损伤之外,近年来,临床应用胰岛素治疗再灌注损伤逐渐受到关注,并且探讨胰岛素在心肌细胞中的信号转导机制成为研究热点。研究发现在缺血心肌中,胰岛素主要发挥抗凋亡作用从而改善心脏功能。同时,我们前期的工作阐明胰岛素在缺血/再灌注心肌中激活了生存信号通路,即PI3-K-Akt-eNOS-NO信号通路,产生抗凋亡作用。胰岛素作用于心肌细胞受体时,除激活PI3-K/Akt信号通路外,还可对另一重要信号通路蛋白家族:MAPKs家族产生影响。而最近的研究表明,在心肌缺血/再灌注导致细胞凋亡的过程中,MAPK家族中的JNK蛋白起了重要作用。再灌注所产生的氧化物可使JNK MAPK得以激活,JNK激活后能磷酸化激活多种转录因子,从而引发细胞程序性死亡。设想在胰岛素激活生存信号的同时,抑制凋亡信号的产生及下传,可能会产生更好的心肌保护作用。但关于胰岛素应用于缺血再灌注心肌时,是否有JNK信号通路参与,以及JNK通路与PI3-K/Akt信号通路间的相互关系,尚未见报道。研究目的1、确定离体心脏给予外源性胰岛素是否可以减少缺血/再灌注损伤导致的细胞凋亡和心肌梗死,从而发挥显著的心脏保护作用。2、研究JNK信号通路是否参与胰岛素对心肌缺血/再灌注损伤的保护,及JNK信号通路对心肌细胞凋亡的影响。3、探讨JNK与PI3-K/Akt信号转导通路间的相互关系及其在胰岛素保护心肌缺血/再灌注损伤中的可能机制。实验方法1、制备SD大鼠离体缺血/再灌注（I 30 min, R 4 h）心脏模型。缺血/再灌注30 min观察:心率（heart rate, HR）、左室压（left ventricular developingpressure, LVDP）、左心室压力的最大瞬时变化速率（ LVdp/dt max）。再灌注2小时测定心肌梗死面积（infarct size, IS）与心肌缺血面积（area at risk,AAR）比值（伊文氏蓝--TTC染色）及Western Blot检测蛋白磷酸化。再灌注4小时行TUNEL检测心肌细胞凋亡。2、动物模型分组为Sham、Control组及Insulin、Ins+LY、Ins+SP和Ins+LY+SP干预组。LY:LY294002,15 mmol/L;SP:SP600125,10 mmol/L。3、Ins+LY、Ins+SP和Ins+LY+SP干预组中,心脏局部缺血前15 min用LY294002（15 mmol/L）或/和SP600125（10 mmol/L）主动脉逆灌;Insulin（50 U/L）。实验结果1、与对照组相比,离体心脏应用胰岛素后HR、LVDP、LVdp/dt max均明显增加;细胞凋亡指数从55.1 2.7%减少到31.9 1.4%（n=6, P<0.01）,梗死面积比减少约16.3%（n=6, P <0.01）,Akt的活性明显增强（n=6, P<0.05）,心脏做功改善,同时JNK活性也增强（n=6, P<0.01）。2、缺血前应用PI3-K/Akt抑制剂LY294002灌注,HR、LVDP和LVdp/dtmax均明显下降（n=6,P<0.01）;凋亡细胞上升为43.8 1.7%;离体心脏梗死面积比为43.5 5.0%,比Insulin组中增加14.6%（n=6,P<0.05）;p-Akt水平下降（Insulin VS. Ins+LY,P<0.05）,JNK磷酸化无变化。3、在Ins+SP组中,p-JNK水平下降,同时Akt磷酸化强度也降低（n=6,P<0.05）。4、相对于Ins+LY组,在Ins+LY+SP组中,离体心脏HR、LVDP和LVdp/dt max均改善;TUNEL阳性细胞下降到29.0 3.0%（n=4,P < 0.05）;梗死面积比为32.5 1.2%（n=4,P<0.05）。结论1、离体给予外源性胰岛素,能够改善缺血/再灌注心脏做功,减少缺血/再灌注导致的细胞凋亡和心梗面积比。2、Akt信号蛋白的激活有利于胰岛素对缺血心肌的保护。3、JNK信号蛋白的激活促进缺血/再灌注心肌细胞凋亡;用SP600125抑制JNK的激活,可产生对缺血/再灌注心肌的保护作用5、外源性给予的胰岛素在缺血/再灌注心肌中激活JNK,但p-JNK可以同时进一步激活Akt,抑制缺血/再灌注导致的心肌损伤。6、胰岛素同时激活Akt和JNKs信号通路;而JNK蛋白的磷酸化促进了Akt蛋白的磷酸化,增加Akt活性,诱导细胞抗凋亡。这种交互机制对胰岛素保护心肌缺血/再灌注损伤有重要意义。