机械牵张对气道黏膜上皮细胞黏蛋白表达的影响及其信号通路研究

论文摘要

目的分别观察呼吸机机械通气、机械牵张对兔气道黏膜和人气道黏膜上皮细胞（HBE16）黏蛋白（MUC）5AC表达的影响,并对其信号通路机制进行初步探讨。方法日本大耳兔随机分为对照组、机械通气1、3、6、12和24h组以及2、5和10cmH2O呼气末正压（PEEP）组。取支气管肺泡灌洗液（BALF）,用ELISA和RT-PCR法检测BALF中肿瘤坏死因子（TNF）-α、白介素（IL）-8、MUC5AC蛋白和mRNA的水平,计数BALF中多型核粒细胞,底物检测法测定中性粒细胞弹力酶（NE）活性。人气道黏膜上皮细胞（HBE16）体外培养,采用小型生物撞击机给予机械牵张刺激,各组培养细胞依施加条件不同而分为对照、牵张、牵张+钆、牵张+硝苯吡啶、牵张+低分子量肝素、牵张+ MARCKS效应结构域（ED）锁核酸（LNA）以及牵张+ MARCKS的ED无关对照LNA序列共7组,采用流式细胞仪检测牵张前后胞内游离Ca2+荧光强度的变化,激光共聚焦显微镜观察胞内游离Ca2+分布的情况,并分别采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫荧光法观察与胞吐相关的突触相关膜蛋白SNAP23以及黏蛋白（MUC）5AC mRNA和蛋白表达,酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测细胞培养上清中MUC5AC分泌。再将构建的人气道黏膜上皮细胞牵张模型,分别给予丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的三条主要通路抑制剂:JNK抑制剂（SP600125）、p38蛋白激酶抑制剂（SB203580）及ERK1/2抑制剂（U0126）（浓度均为30μmol/L）,并设未进行机械牵张的对照组和单纯机械牵张组。分别采用RT-PCR和ELISA方法检测MUC5AC mRNA表达和蛋白分泌量。结果机械通气能显著增强MUC5AC的分泌（P<0.05）。通气3h TNF-α表达至峰值,随后逐渐下降（P<0.05）。通气6h IL-8表达至峰值,随后逐渐下降（P<0.05）。通气12h后多型核粒细胞数及中性粒细胞弹力酶活性显著升高,24h后回降（P<0.05）。随着PEEP的增加,TNF-α、IL-8、MUC5ACmRNA的表达和蛋白含量、多型核粒细胞数和NE活性均随之升高（P<0.05）。机械牵张能显著升高人气道黏膜上皮细胞胞内Ca2+浓度（P<0.01）;同时能显著升高人气道黏膜上皮细胞中SNAP23和MUC5AC表达,显著提升细胞培养上清中MUC5AC分泌（P<0.05）;钆、硝苯吡啶、MARCKS的ED-LNA均能抑制机械牵张对SNAP23表达和MUC5AC表达、分泌的提升作用（均P<0.05）;而低分子量肝素未能显著降低SNAP23表达和MUC5AC表达、分泌（P>0.05）。U0126和SB203580能抑制牵张所致MUC5AC mRNA和蛋白表达增加（均P<0.01）。结论机械通气和牵张能促进气道黏膜上皮细胞MUC5AC mRNA的表达和MUC5AC的分泌,其机制可能与机械通气和牵张引发的炎症反应、张力敏感性阳离子通道、Ca2+内流、MARCKS途径以及ERK1/2、p38 MAPK信号通路有关。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 呼吸机机械通气对气道黏蛋白表达的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二部分 张力敏感性阳离子通道在机械牵张引起气道黏液高分泌中的作用
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 图片
• 第三部分 机械牵张引起气道黏液高分泌的相关信号通路研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 博士期间发表的论文