论文摘要
鱼类淋巴囊肿病（Lymphocystis disease,LCD）是一种世界范围内流行的病毒病,宿主遍及42科125种以上的海水、淡水和半咸水鱼类。研究黏附蛋白与细胞受体以及两者之间的相互作用是探讨淋巴囊肿病毒（Lymphocystis disease virus,LCDV）感染机制和综合防治淋巴囊肿病的一个有效途径。本文利用牙鲆LCDV敏感细胞系—牙鲆鳃细胞系（Flounder gill cell line,FG）,建立了牙鲆LCDV中和抗体的筛选体系,从制备的抗牙鲆LCDV单克隆抗体中,筛选出2株牙鲆LCDV中和单抗,并对病毒的黏附蛋白进行初步确认;利用病毒铺覆蛋白印迹技术（VOPBA）鉴定出牙鲆LCDV靶器官及FG细胞的LCDV受体蛋白,研究分析了FG细胞的LCDV受体蛋白特性及其在病毒感染中的作用。具体结果如下: FG细胞的培养是本文研究的基础,在本文所选择的培养条件下（含10%胎牛血清的Eagle’s MEM培养基培养,pH7.4,温度20℃）,FG细胞生长迅速,状态良好,细胞生长曲线显示,细胞3-4d即可达到增殖顶峰,7d之内均保持良好状态。将粗提的牙鲆LCDV接种于FG细胞,1-2d后细胞即出现明显的病变,半数细胞培养物感染量（TCID50）为22.88/40μL。细胞病变有两种形式,一是细胞崩解、脱落形成明显的空斑,二是细胞融合形成大量的合胞体。利用制备的抗牙鲆LCDV单克隆抗体,通过免疫荧光技术和免疫细胞化学方法,均可检测到FG细胞内增殖的牙鲆LCDV,进一步证实FG细胞是牙鲆LCDV的敏感细胞。另外免疫荧光检测病毒对FG细胞的吸附发现,牙鲆LCDV可与FG细胞表面结合,说明FG细胞表面具有牙鲆LCDV的受体,为受体蛋白的研究提供理论依据。本文利用FG细胞,以患LCD的牙鲆血清和通过免疫获得的兔抗牙鲆LCDV血清为研究对象,通过微量细胞病变中和实验,建立了检测牙鲆LCDV中和抗体的方法,且对中和实验的主要参数包括病毒与血清的孵育条件、病毒与血清的浓度设定以及判定标准进行探讨。结果显示患病牙鲆血清以及兔抗血清对牙鲆LCDV感染都具有明显的中和作用,具有中和效果的血清最高稀释度分别为1:64和1:160。本文采用差速离心和密度梯度法分离提纯了牙鲆LCDV,以此作为抗原,运用单克隆抗体技术,通过免疫荧光抗体技术和斑点免疫印迹技术筛选,有限稀释法克隆出9株分泌抗牙鲆LCDV单克隆抗体的杂交瘤细胞。经微量细胞病变中和实验筛选,得到2株具有中和性的牙鲆LCDV单克隆抗体（3G3和1B2）。Western blotting结果显示,中和单抗3G3和1B2能特异性结合的病毒多肽分子量分别为38.2 kDa和32.9 kDa。本文运用免疫荧光技术,检测到牙鲆的鳃、表皮、肾、胃、肠是牙鲆LCDV的靶器官。提取了各靶器官蛋白,通过病毒铺覆蛋白印迹技术（VOPBA）进行受体蛋白的鉴定,结果如下:鳃组织蛋白中鉴定出1条分子量为37.6 kDa的受体蛋白带;表皮组织蛋白中鉴定出1条分子量为56 kDa的受体蛋白带;胃、肠和肾组织蛋白中均鉴定出1条分子量为27.8 kDa的受体蛋白带。本文利用NP-40裂解和差速离心法,提取了FG细胞的膜蛋白,利用VOPBA鉴定出FG细胞膜上的1个牙鲆LCDV受体蛋白,其分子量大小为37.6 kDa。采用电洗脱的方法提纯了该受体蛋白,双向电泳结果显示此蛋白为单一多肽,其等电点在6.0左右。将该受体蛋白经胰蛋白酶和高碘酸钠作用后,发现病毒与受体蛋白的结合变弱,推测此受体蛋白可能为糖基化的蛋白受体。用该受体蛋白免疫Balb/c小鼠,制备其多抗,免疫荧光结果显示,受体蛋白抗体能够与FG细胞表面结合。通过VOPBA阻断实验发现,稀释50倍和100倍的受体蛋白抗体能够阻断病毒与受体蛋白的结合,稀释200倍的受体蛋白抗体阻断效果不明显。病毒体外感染阻断实验发现,稀释50倍、100倍和200倍的受体蛋白抗体能够在不同程度上阻断病毒的感染。由此推测37.6 kDa受体蛋白可能是介导牙鲆LCDV感染FG细胞的一个功能蛋白。
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标签：牙鲆淋巴囊肿病毒论文; 牙鲆鳃细胞论文; 中和单克隆抗体论文; 病毒黏附蛋白论文; 病毒细胞受体论文;