基于新型发光纳米材料标记的沙门氏菌检测方法研究

论文摘要

随着人们对食品安全问题的关注日益增长,对食品安全检测技术的发展提出了更高的要求,要求检测技术能够更简单、快速、灵敏和高效。21世纪飞速发展的纳米技术和生物技术将纳米材料引入生物探针和传感领域,利用纳米材料构建纳米探针和传感器,可有效提高分析测定中灵敏度、稳定性等分析性能。目前常用的生物分析标记物主要有酶或底物、荧光染料等一些荧光物质。但这些传统生物分析标记物因其固有的缺陷,在很大程度上限制其发展和应用。上转换纳米材料是一种特殊的荧光纳米材料,具有将长波辐射转换成短波辐射,发射出比激发光波长短的荧光的特点。同时上转换纳米材料还具有毒性低、化学稳定性高、发光强度高而稳定、Stokes位移大等一系列优点,使其受到了众多研究者的广泛关注,成为荧光纳米材料中发展前景极好的一种纳米材料。本文首先以氧化钇,氧化镱,氧化铒等为原料,在较温和的条件下制备粒径大小为50 nm、亲水性、光稳定性俱佳的上转换发光纳米颗粒。采用TEM、XRD、FT-IR、荧光光谱等对其进行了表征,随后对纳米材料的表面进行功能化修饰,成功制备了表面氨基修饰的上转换纳米颗粒。同时制备了结晶度高、尺寸均匀、表面功能化、具有良好水溶性的磁性纳米颗粒,同样对其进行表面生物功能化,以便应用于痕量核酸的磁分离与富集研究。其次,将所制备上转换荧光纳米颗粒作为发光标记物,磁性纳米颗粒作为高效分离介质,基于纳米探针技术、核酸杂交技术和荧光分析技术,发展一种革兰氏阴性菌沙门氏菌特异性目标DNA的快速灵敏的检测方法。研究发现,在最佳实验条件下,荧光强度和沙门氏菌DNA浓度在0.01-10 pmol/L范围内呈良好的线性关系,检出限为3 fmol/L,相对标准偏差为2.6 %（1 pmol/L, n=11）。该方法体系已成功应用于实际样品中沙门氏菌的检测。再次,基于荧光共振能量转移（FRET）原理,将所制备上转换荧光纳米颗粒作为标记物,纳米金作为能量接受淬灭剂,发展一种均相体系中沙门氏菌特异性目标DNA的荧光检测方法。研究发现,在最佳实验条件下,荧光强度和沙门氏菌DNA浓度在0.001-1 pmol/L范围内呈线性,检出限为1 fmol/L,相对标准偏差为3.7 %（0.01 pmol/L, n=11）。该方法体系也已成功应用于实际样品中沙门氏菌的检测。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 纳米材料在生物标记中的研究进展
• 1.1.1 生物标记的发展
• 1.1.2 荧光染料
• 1.1.3 量子点
• 1.1.4 稀土纳米发光材料
• 1.1.4.1 稀土元素所具有的特征
• 1.1.4.2 稀土上转换纳米材料常用制备方法和表面功能化方法
• 1.1.4.3 稀土上转换纳米材料应用
• 1.1.5 磁性纳米材料
• 1.1.6 荧光共振能量转移技术
• 1.2 研究课题的立题意义与研究内容
• 1.2.1 本课题的立题意义
• 1.2.2 本课题的研究内容
• 1.2.2.1 生物功能化上转换荧光纳米颗粒和磁性纳米颗粒的制备
• 1.2.2.2 基于上转换荧光纳米颗粒标记及磁性纳米颗粒磁分离技术的沙门氏菌DNA杂交分析方法研究
• 1.2.2.3 基于上转换荧光纳米颗粒－纳米金FRET 技术的沙门氏菌DNA 分析方法研究
• 2 实验部分
• 2.1 材料与主要试剂
• 2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 上转换荧光纳米颗粒和磁性纳米颗粒的制备和表面功能化
• 4:Yb³⁺Er³⁺纳米颗粒的制备和表征'>2.3.1.1 NaYF₄:Yb³⁺Er³⁺纳米颗粒的制备和表征
• 4:Yb³⁺Er³⁺纳米颗粒的表面功能化和表征'>2.3.1.2 NaYF₄:Yb³⁺Er³⁺纳米颗粒的表面功能化和表征
• 2.3.1.3 氨基化磁性纳米颗粒的制备和表征
• 2.3.1.4 纳米颗粒和亲和素的结合
• 2.3.2 基于上转换荧光纳米颗粒标记及磁性纳米颗粒磁分离技术的沙门氏菌DNA杂交分析方法研究
• 2.3.2.1 上转换荧光显示探针的制备
• 2.3.2.2 磁分离捕获探针的制备
• 2.3.2.3 DNA 杂交
• 2.3.2.4 荧光强度检测
• 2.3.3 基于上转换荧光纳米颗粒－纳米金FRET 技术的沙门氏菌DNA 分析方法研究
• 2.3.3.1 纳米金的制备
• 2.3.3.2 纳米金淬灭探针的制备
• 2.3.3.3 上转换荧光探针的制备
• 2.3.3.4 FRET 共振能量转移
• 2.3.4 沙门氏菌DNA 的检测
• 2.3.4.1 菌株的培养
• 2.3.4.2 沙门氏菌计数
• 2.3.4.3 沙门氏菌DNA 的提取
• 2.3.4.4 牛奶样品中沙门氏菌的检测
• 3 结果与讨论
• 3.1 上转换荧光纳米颗粒和磁性纳米颗粒的制备和表面功能化
• 4₄:Yb³⁺Er³⁺纳米颗粒的表征'>3.1.1 NaYF₄₄:Yb³⁺Er³⁺纳米颗粒的表征
• 44:Yb³⁺Er³⁺的表征'>3.1.2 表面功能化 NaYF₄4:Yb³⁺Er³⁺的表征
• 3.1.3 磁性纳米颗粒的表征
• 3.1.4 亲和素的连接
• 3.2 基于上转换荧光纳米颗粒标记及磁性纳米颗粒磁分离富集技术的沙门氏菌DNA杂交分析方法研究
• 3.2.1 磁性纳米颗粒结合亲和素优化分析
• 3.2.2 磁分离捕获探针的优化
• 3.2.3 上转换荧光显示探针的优化
• 3.2.4 分析性能
• 3.2.5 特异性分析
• 3.2.6 沙门氏菌DNA 的提取与检测
• 3.2.7 牛奶中沙门氏菌DNA 的提取与检测
• 3.3 基于上转换荧光纳米颗粒-纳米金FRET 技术的沙门氏菌DNA 分析方法研究
• 3.3.1 纳米金淬灭探针的制备
• 3.3.2 上转换荧光纳米探针的优化
• 3.3.3 分析性能
• 3.3.4 特异性分析
• 3.3.5 沙门氏菌DNA 的提取与检测
• 3.3.6 牛奶中沙门氏菌DNA 的提取与检测
• 4 结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文