RNA干扰对HepG2细胞AFP基因表达的影响

论文摘要

目的:研究 RNA 干扰（RNAi）技术对 HepG2 细胞 AFP 基因表达的影响,以及抑制 AFP 表达后对 HepG2 细胞增殖及凋亡作用的影响。 方法:第一部分 RNA 干扰（RNA interference RNAi）抑制 HepG2 细胞 AFP 基因表达方法的建立。 1.目标基因序列的选择及质粒载体构建,经Blast 软件查对及序列同源性分析,选择两条目标基因序列——AFP1 与AFP2,构建质粒载体 pGenesil-1-AFP1（含绿色荧光蛋白编码序列）及pGenesil-2-AFP2。2.用阳离子脂质体 META/质粒载体 pGenesil-1-AFP1 不同剂量及浓度配比转染 HepG2 细胞,荧光显微镜观察转染效率,并检测细胞培养上清液 AFP 的量的变化,筛选出最佳阳离子脂质体 META/质粒载体pGenesil-1-AFP1 配比。第二部分 RNA 干扰技术对 HepG2 细胞 AFP 基因表达的影响。1. 转染试剂 METAFECTENE/质粒载体混合液配制及转染细胞。2.采用微粒子化学发光免疫分析法检测转染后 24,48,72 小时培养上清液中AFP的含量。3. 采用间接免疫细胞化学技术观察处理组和对照组细胞内AFP基因表达情况,了解在细胞水平 pGenesil-AFP-siRNA 对 AFP 表达的抑制作用。第三部分 siRNA 抑制 AFP 表达对 HepG2 细胞增殖及凋亡的影响。分别应用 MTT 比色法,DNA Fragmentation 及检测细胞内 cAMP 水平来观察。 结果:1. 筛选出最佳的阳离子脂质体META/质粒载体pGenesil-1-AFP1转染复合物的配比为 8μl:2.5μg。 2. 转染 pGenesil-1-siAFP1 与pGenesil-2-siAFP2 的实验组与对照组比较,AFP 含量下降明显（P<0.01）;pGenesil-1-siAFP1 实验组与 pGenesil-2-siAFP2 实验组比较,AFP 含量在各 时 段 均 显 著 下 降 。 3. pGenesil-1-siAFP1 的 实 验 组 干 扰 后 DNAFragmentation 观察无细胞凋亡,但是 MTT 比色法发现 siRNA-AFP1 的实验组对细胞增殖有明显的抑制作用,对细胞增殖抑制率最高达 51.35%。。而且实验组细胞内的 cAMP 浓度（15.64μmol/L）明显低于各对照组细胞内的cAMP 浓度（P<0.01）。 结论: RNA 干扰技术能有效地抑制 HepG2 细胞 AFP 基因表达,这种方法不仅对体外研究 AFP 基因功能有一定意义,而且为进一步研究应用 RNA 干扰技术抗肿瘤治疗提供了依据。

论文目录

• 摘要
• 前言
• 第一章 RNA 干扰抑制 HepG2 细胞 AFP 基因表达方法的建立
• 第二章 RNA 干扰技术对HepG2 细胞 AFP 基因表达的影响
• 第三章 siRNA 抑制AFP 表达对HepG2 细胞增殖的影响
• 第四章 讨论
• 参考文献
• 综述
• 个人简历
• 致谢