六味地黄丸预防OLETF鼠糖尿病发病机制的实验研究

论文摘要

【背景】随着社会经济的发展和人们生活方式的改变,糖尿病已经成为继心血管疾病和肿瘤之后的第三大严重危害人类健康的慢性非传染性疾病,其患病率在全球范围内呈逐年增高的趋势,给个人和社会带来巨大的经济负担。目前,临床上仍然缺乏有效的手段来控制糖尿病及其并发症的发生与发展,预防糖尿病的发生,并从根本上消除糖尿病带来的危害,成为最受人们关注的问题之一。美国糖尿病预防试验（DPP）和STOP-NIDDM等循证医学研究表明:占全部糖尿病患者90%以上的2型糖尿病是可以预防的,采取干预措施可以使2型糖尿病发病危险降低31%～58%。然而,目前的预防手段都不同程度面临着干预药物毒副反应大、药物价格昂贵、患者依从性差等明显问题,因此,寻找更为有效、经济、不良反应小的预防糖尿病药物成为目前药物预防高危人群糖尿病发病研究的热点。2型糖尿病的发病机制尚未完全阐明,目前认为胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损是2型糖尿病最重要的两个发病因素,其中胰岛素抵抗在2型糖尿病的发病过程中有可能起始动作用并贯穿该病的全过程。因此,改善胰岛素抵抗对于预防和治疗2型糖尿病至关重要。胰岛素抵抗是许多临床疾病（如高血压、动脉粥样硬化等）,尤其是常见的内分泌代谢性疾病的共同危险因素,已经成为许多学科共同感兴趣的研究热点。胰岛素抵抗是亚细胞、细胞、组织或机体的一种病理生理状态,当机体出现胰岛素抵抗时,胰岛素刺激的葡萄糖利用减少,同时不能有效抑制肝糖原分解输出葡萄糖,从而导致血糖升高并最终导致糖尿病的出现。随着对胰岛素抵抗研究的深入,人们发现许多激素和细胞因子,尤其是脂肪细胞分泌的多个细胞因子,在胰岛素抵抗的发病中起着重要作用。脂联素是脂肪组织分泌的细胞因子之一,与能量代谢、胰岛素抵抗的关系非常密切。研究发现,血浆脂联素的浓度与身体脂肪构成比、腰臀比例、空腹胰岛素浓度以及餐后2h葡萄糖浓度呈负相关,与胰岛素敏感性呈正相关,血浆脂联素水平的降低在肥胖早期已经存在,在发生2型糖尿病后继续降低,提示血浆脂联素水平的降低与胰岛素抵抗有着密切的联系。脂联素有望成为一种胰岛素敏感性的指标,甚至可能成为一种治疗胰岛素抵抗和糖尿病的有效药物。炎症及炎症介质在2型糖尿病发病机制中的作用也日益引起学术界的关注。其中,核因子-κB（Nuclear.factor-κB,NF-κB）作为炎症启动、调节的关键核因子,是研究的热点。但是,NF-κB如何调控炎症继而导致2型糖尿病的发生的具体机制,以及炎症与胰岛素抵抗在2型糖尿病发病中的相互关系目前尚未明确。为更好地阐明2型糖尿病的发病机制,我们有必要探讨炎症与胰岛素抵抗的关系。目前,国内外已有文献报道,NF-κB抑制物激酶(（IκB kinase,IKK）是联系炎症与胰岛素抵抗的重要纽带。生理情况下,NF-κB与其抑制物IκB（Inhibitor of NF-κB）结合,以无活性的形式存在于细胞浆内,一旦IκB激酶IKK被肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）等炎症因子激活后,使IκB磷酸化并与NF-κB解离,解除抑制的NF-κB进入细胞核内,调节一系列炎症反应。IKK既是调节炎症的重要因素,同时IKK又是胰岛素受体和胰岛素受体底物（Insulin receptor substrate,IRS）的丝氨酸磷酸化激酶,它可使IRS 307位的丝氨酸磷酸化,导致正常的酪氨酸磷酸化受抑制,并减弱胰岛素受体与IRS的结合以及终止胰岛素信号向磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol-3 kinase,PI3-K）传递;另外,IRS的丝氨酸磷酸化还可以增加IRS的降解,并使IRS成为胰岛素受体激酶的抑制物。综上所述,IKK是将炎症和IR联系起来的重要枢纽。因此,在对糖尿病干预的研究中,探讨干预药物对IKK/NF-κB通路的影响,不仅对阐明胰岛素抵抗和炎症在2型糖尿病的发病机制中的作用有着重要意义,而且对于干预药物的作用机制的阐明也非常必要。近年来,随着中西医结合治疗糖尿病研究的不断进展,中药复方制剂及其活性成分在治疗糖尿病方面的作用得到越来越多的重视。我们在前期研究中发现,六味地黄丸能够延缓糖尿病动物模型OLETF（Otsuka Long-Evans TokushimaFatty）鼠的餐后高血糖的出现,降低糖尿病发病率,对糖尿病的预防具有重要的作用。国内外研究显示,六味地黄丸具有调节糖代谢、增加肝糖原含量、抗炎和抗氧化作用。因此我们推测,六味地黄丸可能通过影响炎症的有关通路,改善胰岛素抵抗,从而预防2型糖尿病的发病。故本实验以IKK/NF-κB通路为切入点,探讨六味地黄丸对糖尿病大鼠胰岛素敏感器官中IKK的干预作用及其对2型糖尿病的预防作用机制。第1部分六味地黄丸对OLETF鼠胰岛素抵抗的影响【目的】探讨六味地黄丸能否改善OLETF鼠的胰岛素抵抗,观察六味地黄丸对OLETF鼠血浆脂联素水平、脂肪组织中脂联素mRNA表达量以及胰岛素敏感性的影响。【方法】1.以自发性2型糖尿病大鼠模型OLETF鼠和其同系非糖尿病对照鼠LETO鼠为实验对象。大鼠皆为雄性,共分三组。OLETF鼠干预组（干预组）和OLETF鼠对照组（对照组）,各20只;LETO鼠10只作为正常对照组（LETO组）。从8周龄开始,干预组予六味地黄丸溶液灌胃(2.4g·kg-1d-1),其余两组以等量蒸馏水灌胃。分别于8周龄、32周龄和40周龄时随机处死大鼠,采集血标本,分离大鼠胰腺及肝脏组织,置于液氮中保存备用;2.检测空腹血清葡萄糖、游离脂肪酸、甘油三酯、胆固醇、血浆胰岛素和脂联素水平;3.采用RT-PCR,检测脂肪组织中脂联素mRNA的表达;4.计算胰岛素敏感指数（ISI）;5.分析血浆脂联素水平与各相关指标的相关性。【结果】1.与LETO组相比,对照组除空腹血糖升高不显著外,空腹血浆胰岛素、血清甘油三酯、胆固醇均显著升高,胰岛素敏感指数显著降低;2.对照组血浆脂联素水平和脂肪组织脂联素mRNA表达量与LETO组相比显著降低;3.干预组空腹血糖与对照组相比无明显变化,但空腹胰岛素和血清甘油三酯、胆固醇均显著降低,胰岛素敏感指数显著增高;4.与对照组相比,干预组的血浆脂联素水平和脂肪组织脂联素mRNA表达量均明显增加;5.对照组血浆脂联素与胰岛素敏感指数呈正相关,而与空腹胰岛素、甘油三酯、游离脂肪酸、胆固醇呈负相关。【结论】1.OLETF鼠脂联素水平与胰岛素敏感性呈正相关;2.OLETF鼠脂联素水平与游离脂肪酸、甘油三酯水平呈负相关;3.六味地黄丸能明显增加OLETF鼠脂肪组织脂联素mRNA表达水平,升高血浆脂联素水平;4.六味地黄丸能有效调节血脂异常和改善胰岛素抵抗。第2部分六味地黄丸对OLETF鼠肝脏及胰腺的形态学影响【目的】通过观察六味地黄丸对OLETF鼠肝脏及胰腺的形态学影响,探讨六味地黄丸对OLETF鼠肝脏和胰腺组织是否具有保护作用。【方法】1.实验动物、分组和干预措施同第1部分;2.从液氮中取出已分离的大鼠胰腺及肝脏组织后,置于10%多聚甲醛中固定24小时,包埋蜡块;3.石蜡切片机间隔4um连续切片,相邻切片分别用标准HE染色观察大鼠肝脏及胰腺组织学改变;4.特殊染色:根据HE结果,对对照组及干预组大鼠肝脏及胰腺以冰冻切片进行MASSON染色及PAS染色,以进一步明确病变性质。【结果】1.8周龄时,各组大鼠胰岛结构无明显差别。32周龄,干预组和对照组胰岛明显比LETO组肥大,并有纤维组织长入,对照组大鼠胰岛纤维化更加明显,胰岛结构排列紊乱。40周龄,对照组大鼠胰岛形状更不规则,纤维组织大量增生,多数胰岛失去正常结构,胰岛明显萎缩。干预组大鼠胰岛基本保持正常结构,无明显肥大或萎缩;2.8周龄时,各组大鼠肝脏结构亦无明显差别。32周龄,对照组及干预组大鼠肝细胞均出现明显空泡样变性,而LETO组大鼠肝小叶结构依然整齐,肝细胞以中央静脉为中心排列成索状。40周龄,对照组大鼠肝细胞空泡样变性更加明显,干预组较32周时改善,可见轻度肝索排列紊乱,部分肝细胞空泡化;3.8周龄时,各组大鼠肝脏PAS染色无明显差别,肝细胞中未见明确的红色颗粒;32周龄,PAS染色对照组及干预组肝细胞的胞质及胞核均可见到的红色颗粒;40周龄,对照组肝细胞中红色颗粒更加丰富,而干预组肝细胞中红色颗粒明显减少;4.各组各周龄大鼠肝脏未见到纤维组织增生。【结论】1.六味地黄丸有助于保持大鼠肝脏及胰腺的正常结构;2.随着糖尿病病程进展,OLETE大鼠肝脏的脂肪浸润、糖原累积及胰腺纤维变性呈渐进性加重;3.六味地黄丸能够通过保护OLETF大鼠胰岛及肝脏的正常形态结构,达到维持胰岛素敏感器官胰腺和肝脏的生理功能作用。第3部分六味地黄丸对OLETF鼠IKK/NF-κB通路的影响【目的】观察六味地黄丸对OLETF鼠IKK/NF-κB通路的影响,探讨六味地黄丸是否可以通过抑制IKK、NF-κB的表达而起到改善OLETF鼠胰岛素抵抗的作用。【方法】1.实验动物、分组和干预措施同第1部分;2.免疫荧光染色检测IKKβ在各组大鼠胰腺组织中的表达情况;3.免疫荧光染色检测IKKβ在各组大鼠肝脏组织中的表达情况;4.免疫荧光染色法检测各组大鼠胰腺组织中P-IRS-1的表达情况;5.免疫荧光染色法检测各组大鼠肝脏组织中P-IRS-1的表达情况;6.免疫组化法检测NF-κB在各组大鼠肝脏及胰腺的表达情况,用图像分析系统分析结果;7.分析IKKβ、NF-κB及P-IRS-1的相关性;8.实验数据计量资料以均数±标准差（（?）±s）。采用SPSS10.0软件进行统计分析,两样本间计量资料的比较采用t检验。多组间资料比较采用单因素方差分析（ANOVA）检验。各因子之间的双变量相关性采用等级相关系数（Spearman秩相关系数）的非参数方法。【结果】1.六味地黄丸对肝脏中IKKβ表达的影响各组IKKβ的表达都随周龄延长而增加,且这种差异有统计学意义。8周龄时,对照组IKKβ表达已高于LETO组（P＜0.001）。32周龄时,对照组IKKβ表达显著高于LETO组和干预组（P＜0.001）;与LETO组相比,干预组IKKβ表达情况无显著差别（P＞0.05）。40周龄时,IKKβ表达仍然是在对照组最高,干预组其次,LETO组最低,差异有统计学意义（P＜0.001）。2.六味地黄丸对胰腺中IKKβ表达的影响各组IKKβ的表达都随周龄延长而逐渐增加,但在LETO组和对照组32周龄与40周龄时的差异无统计学意义（P分别为0.414和0.390）。8周龄时,对照组IKKβ蛋白表达高于LETO组,差异有统计学意义（P＜0.05）。32周龄时,IKKβ蛋白的表达在对照组最高,干预组其次,LETO组最低,差异有统计学意义（P＜0.05）。40周龄时,各组IKKβ的表达都有不同程度升高,IKKβ表达依然是对照组最高,干预组其次,LETO组最低,且各组间的差异均有统计学意义（P＜0.001）。3.六味地黄丸对大鼠肝脏NF-κβ表达的影响同周龄各组间比较,8周龄时,对照组NF-κβ的表达显著高于LETO组（P＜0.05）。32周龄时,与LETO组相比,对照组NF-κβ的表达水平显著升高,干预组次之,各组间差别有统计学意义（P＜0.001）。40周龄时,对照组NF-κB的表达进一步升高,显著高于干预组和LETO组,干预组仍然介于对照组和LETO组之间,各组间差异有统计学意义（P＜0.001）。4.六味地黄丸对大鼠胰腺NF-κβ表达的影响同周龄各组间比较,8周龄时,对照组胰腺中NF-κB的表达就开始显著高于LETO组（P＜0.05）:32周龄时,与LETO组大鼠相比,对照组和干预组NF-κB的表达量均显著增高（P＜0.05）;干预组低于对照组,但差异无统计学意义（P=0.082）。40周龄时,对照组和干预组胰腺中NF-κB表达量仍然都显著低于LETO组（P＜0.05）,干预组胰腺中NF-κB表达量仍低于对照组,但差异无统计学意义（P=0.060）。5.六味地黄丸对大鼠肝脏P-IRS-1表达的影响同周龄各组间比较,8周龄时,LETO组P-IRS-1的表达即显著高于对照组（P＜0.05）。32周龄时,P-IRS-1在肝脏的表达在LETO组最高,干预组次之,对照组最低,差异显著（P＜0.001）。40周龄时,LETO组P-IRS-1的表达进一步升高,显著高于干预组和对照组,对照组则呈下降趋势,仍在三组中表达最低,各组间差异有统计学意义（P＜0.001）。6.六味地黄丸对大鼠胰腺P-IRS-1表达的影响8周龄时,LETO组P-IRS-1的在胰腺中的表达显著高于对照组（P＜0.001）。32周龄时,对照组显著低于LETO组和干预组,干预组低于LETO组,各组间差异具有统计学意义（P＜0.001）。40周龄时,P-IRS-1在LETO组最高,干预组次之,对照组最低,差异有统计学意义（P＜0.001）。7.肝脏中IKKβ、NF-κB与P-IRS-1的相关性分析相同周龄时,肝脏中IKKβ、NF-κB与P-IRS-1的相关分析结果:8周龄,IKKβ与NF-κB的表达呈正相关,相关性显著（rs=0.909,P＜0.001）;IKKβ、NF-κB均与P-IRS-1呈负相关,相关性不显著（P=0.208）。32周龄时,IKKβ与NF-κB的表达呈显著正相关（rs=0.884,P＜0.001）,IKKβ与P-IRS-1呈负相关（rs=-0.75,P=0.02）,NF-κB与P-IRS-1呈显著负相关（rs=-0.867,P=0.002）。40周龄时,IKKβ与NF-κB的仍呈显著正相关（rs=0.913,P＜0.001）,且均与P-IRS-1显著负相关（P＜0.001）。8.胰腺中IKKβ、NF-κB与P-IRS-1的相关性分析相同周龄时,胰腺中IKKβ、NF-κB与P-IRS-1的相关分析结果:8周龄,IKKβ与NF-κB的表达呈显著正相关（rs=0.951,P＜0.001）,均与P-IRS-1呈负相关,相关性不显著（P=0.198）。32周龄时,IKKβ与NF-κB的呈正相关,相关性显著（rs=0.903,P＜0.001）,IKKβ与P-IRS-1呈显著负相关（rs=-0.828,P＜0.05）,NF-κB与P-IRS-1呈负相关（rs=-0.75,P＜0.05）。40周龄时,IKKβ与NF-κB的仍呈显著正相关（rs=0.901,P＜0.001）,且均与P-IRS-1显著负相关（P＜0.001）。【结论】1.六味地黄丸能降低OLETF鼠IKKβ、NF-κB的表达,减轻炎症反应对肝脏和胰腺的损害;2.六昧地黄丸能增加OLETF鼠肝脏及胰腺组织中P-IRS-1的表达水平,改善胰岛素抵抗;3.OLETF鼠肝脏中IKKβ与NF-κB的表达在各周龄时均呈高度正相关（P＜0.001）;与IRS-1表达呈负相关,其中32周龄和40周龄时相关性有统计学意义（P＜0.02）。在胰腺组织中有同样的趋势。提示了IKK在炎症与胰岛素抵抗中具有桥梁作用;4.六味地黄丸通过降低IKKβ的表达,达到改善胰岛素抵抗和抗炎作用,可能是其预防2型糖尿病发病的基本机制之一。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第1部分 六味地黄丸对OLETF鼠胰岛素抵抗的影响
• 第1节 实验材料
• 第2节 实验方法
• 第3节 结果
• 第4节 讨论
• 第2部分 六味地黄丸对OLETF鼠肝脏及胰腺的形态学影响
• 第1节 实验材料
• 第2节 实验方法
• 第3节 结果
• 第4节 讨论
• 第3部分 六味地黄丸对OLETF鼠IKK/NF-κB通路的影响
• 第1节 实验材料
• 第2节 实验方法
• 第3节 结果
• 第4节 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间成果
• 致谢