气升式环流中空纤维膜生物反应器内骨髓间充质干细胞的培养与扩增

论文摘要

骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）不仅具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等多个方向分化的潜能，还具有支持造血的重要功能，并且植入反应弱，易于被外源基因转染并稳定表达，是组织工程、细胞及基因治疗中理想的靶细胞。因此，MSCs正作为一种新型的“种子细胞”受到广泛关注。但是骨髓中的MSCs的含量非常少，仅占整个骨髓有核细胞的1／20000～1／30000；并且随着个体年龄的增加，MSCs的数量逐渐减少、活性逐渐降低，很难满足自体修复和临床治疗的需求。已有的体外扩增方法存在着细胞扩增数量有限、细胞受到损伤较大、容易失去干细胞特性以及培养体系资源浪费等缺陷，达不到理想的培养效果。为了提高MSCs的扩增倍数并保持干细胞特征，本文采用气升式环流中空纤维膜生物反应器（air-lift loop hollow fiber membrane bioreactor，ALHFMB）进行体外扩增MSCs。将第四代骨髓间充质干细胞与含有bFGF的Ⅰ型胶原溶液混合后接种于中空纤维膜内，置37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱孵育1小时后在膜内形成含有细胞的凝胶。然后将此中空纤维膜接种至气升式环流生物反应器（air-lift loop bioreactor，ALB）内，加入含有bFGF的培养基，进行骨髓间充质干细胞三维动态培养与扩增。实验过程中每24小时取样测吸光度、计细胞数、绘制细胞生长曲线，测定细胞代谢参数，并对扩增的细胞进行流式细胞仪分析及多向诱导分化检测。结果表明，在ALHFMB内，O2含量基本保持恒定；细胞代谢旺盛，MSCs扩增倍数明显增加，7天后接种密度为5×105cells／mL时MSCs扩增16倍，显著高于T-flask内近6倍的扩增倍数；接种密度为1×105cells／mL时MSCs扩增37倍，显著高于T-flask内近12倍的扩增倍数；并且扩增的细胞仍能保持其自身表型并具有较强的成骨、成软骨及成脂肪的多向分化能力。证明本文所采用的培养方法是体外培养与扩增MSCs的一种有效的方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）
• 1.1.1 干细胞定义及分类
• 1.1.2 骨髓间充质干细胞的定义
• 1.1.3 骨髓间充质干细胞的生物学特性
• 1.1.4 间充质干细胞的表面标记
• 1.1.5 骨髓间充质干细胞的诱导分化潜能
• 1.1.6 骨髓间充质干细胞在组织工程中的应用
• 1.1.7 骨髓间充质干细胞的体外分离、纯化与培养
• 1.2 体外培养细胞的营养条件
• 1.3 动物细胞培养用生物反应器
• 1.3.1 生物反应器发展概况
• 1.3.2 细胞培养对生物反应器的要求
• 1.3.3 生物反应器的几种类型
• 1.4 胶原
• 1.5 聚偏氟乙烯中空纤维膜
• 1.6 小结
• 2 骨髓间充质干细胞的获取及体外培养
• 2.1 实验材料与方法
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 实验药品及试剂
• 2.1.3 实验所需溶液和试剂的配制
• 2.1.4 实验仪器
• 2.1.5 原代培养
• 2.1.6 传代培养
• 2.1.7 冻存和复苏
• 2.2 实验结果与讨论
• 2.3 小结
• 3 气升式环流中空纤维膜生物反应器内培养骨髓间充质干细胞
• 3.1 实验设备与材料
• 3.1.1 实验设备
• 3.1.2 实验所需溶液和试剂的配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 培养条件的选择
• 3.2.2 ALHFMB内MSCs的培养
• 3.2.4 细胞计数
• 3.2.5 细胞营养物质代谢参数检测
• 3.2.6 ALHFMB内氧、二氧化碳分压及pH值的测定
• 3.2.7 骨髓间充质干细胞的鉴定
• 3.2.8 数据统计与分析
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 胶原浓度及细胞接种密度
• 3.3.2 MSCs生长曲线与扩增倍数
• 3.3.3 细胞代谢参数检测
• 3.3.4 不同培养方式下pH值的比较
• 3.3.5 反应器内培养基的氧及二氧化碳分压
• 3.3.6 扩增细胞的鉴定
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录A 附录内容名称
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢