论文摘要
肝细胞肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,目前已成为我国第二位的恶性肿瘤致死原因。肝癌治疗目前仍以手术为主的综合治疗,但中晚期患者常常由于肝癌发生了转移而失去实施手术的机会。而在临床中,肝癌的侵袭转移和术后复发是患者死亡的主要原因。所以,肝癌的转移与复发成为当前肝癌治疗研究的热点问题。虽然目前对肝癌转移的相关因素研究较多,但确切的机制仍不清楚。新近的研究表明,糖原合成酶激酶（GSK）-3β在细胞的迁移过程中起可能起到重要作用。GSK-3是一个丝氨酸/苏氨酸类激酶,早期研究认为该酶的功能在于磷酸化肝糖原合成酶（GS）并使之失活。后来研究表明,该酶可磷酸化众多底物,从而发挥调节细胞增殖、凋亡等许多重要的细胞功能,在蛋白合成、细胞增殖、细胞分化和细胞运动等诸多方面,都扮演着相当重要的角色。GSK-3广泛的存在于真核生物中,在哺乳动物体内发现有两种亚型存在,即GSK-3α和GSK-3β,GSK-3β是两个亚型中较小的一个,由482个氨基酸组成,分子量为47kD。GSK-3β最初由骨骼肌中分离出来,但该酶广泛表达于动物的所有组织,特别在大脑。GSK-3β与多种情况下的细胞凋亡有关,但是确切的机制还不是很清楚。目前已有研究表明GSK-3β在肝癌的发生发展过程中起到了重要作用,并参与了肝癌细胞生长和细胞凋亡信号通路调控。Patricia等人发现,通过抑制GSK-3β的活性可有效地抑制肝癌细胞的生长。但是,GSK-3β是否参与了肝癌细胞的转移仍然是个有待于研究的问题。因此,本研究通过改变GSK-3β的活性来观察其对肝癌细胞迁移能力的影响,以期了解GSK-3β在肝癌细胞迁移过程中所扮演的角色,为原发性肝癌的治疗提供新的靶点。1.下调GSK-3β活性对肝癌细胞迁移能力的影响目的:通过药理学方法抑制GSK-3β活性观察其对肝癌细胞迁移速度的影响。方法:应用药理学方法,以GSK-3β特异性的抑制剂LiCl和SB216763分别抑制SMMC-7721和Hep3B细胞中GSK-3β的活性,通过划痕试验检测不同活性状态下肝癌细胞迁移能力的差别。结果:划痕24h后,SMMC-7721细胞的相对迁移率分别下降36.44%和41.78%;Hep3B细胞的相对迁移率都下降26.66%。其中,SMMC-7721细胞对抑制剂的反应比Hep3B细胞更敏感,迁移率降低40%左右。并且发现Hep3B细胞对SB216763和LiCl敏感程度相当,而SMMC-7721对SB216763较为敏感。结论:应用GSK-3特异性抑制剂后,单位时间内肝癌细胞Hep3B和SMMC-7721的迁移率较对照组明显降低,证明GSK-3β的活性下调后肝癌细胞的迁移能力降低。2.GSK-3βS9A、GSK-3βWT、GID5-6对肝癌细胞迁移能力的影响:目的:通过调节GSK-3β活性观察其对肝癌细胞迁移速度的影响。方法:应用载体表达法,通过chamber小室观察转染不同质粒后,SMMC-7721肝癌细胞迁移能力的变化。结果:转染GSK-3βWT、GSK-3βS9A后,肝癌细胞中GSK-3β的活性被增强,而其相对迁移率却分别下降为30.9%和18.09%;而转染GID5-6后,肝癌细胞的相对迁移率下降为18.04%。结论:肝癌细胞的迁移能力不仅与GSK-3β的活性有关,也与其他一些影响因素相关。结合GSK-3β在神经细胞的发育过程中,p-GSK-3β的不对称分布影响其极性形成这一事实,我们认为p-GSK-3β的不对称分布可能也参与影响肝癌细胞迁移的过程之中。3.肝癌细胞迁移过程中GSK-3β活性的改变目的:了解正常情况下,肝癌细胞迁移过程中GSK-3β活性的改变的规律。方法:利用划痕的方法建立肝癌细胞迁移的模型,应用蛋白印记法检测肝癌细胞发生迁移后不同时间点GSK-3β活性的变化。结果:肝癌细胞发生迁移后,磷酸化GSK-3β表达逐渐增强,在2-6h达到高峰,8h后表达逐渐减弱。结论:细胞迁移过程中由于上游激酶的活化,GSK-3β的磷酸化水平不断上调;在肝癌细胞发生迁移8h后,磷酸化GSK-3β逐渐减弱,慢慢恢复正常水平。4.GSK-3β抑制剂对肝癌细胞内p-GSK-3β分布的影响:目的:通过抑制GSK-3β活性观察其对肝癌细胞迁移过程中的影响。方法:应用药理学方法,以GSK-3β特异性的抑制剂LiCl抑制Hep3B细胞中GSK-3β的活性,通过细胞组化观察其对肝癌细胞迁移过程中p-GSK-3β在胞内分布的影响。结果:在正常培养的条件下,肝癌细胞发生迁移3h后,细胞内p-GSK-3β呈现出在细胞前沿边缘附集的现象,而加入GSK-3β的抑制剂LiCl后,p-GSK-3β的分布未呈现这种边缘附集的现象。结论:在肝癌细胞迁移过程中,p-GSK-3β呈现出一种不对称分布的现象,且这种不对称与细胞迁移的方向一致。应用GSK-3β的抑制剂后,肝癌细胞内p-GSK-3β的这种不对称分布的现象被破坏,同时影响了肝癌细胞的迁移速度以及方向。5.抑制GSK-3β活性对肝癌细胞极性的影响:目的:通过抑制GSK-3β活性观察其对肝癌细胞迁移方向的影响。方法:应用药理学方法,以GSK-3β特异性的抑制剂LiCl和SB216763分别抑制SMMC-7721和Hep3B细胞中GSK-3β的活性,通过微管组织中心体（MTOC）实验检测不同活性状态下肝癌细胞的迁移方向的差别。结果:未加入抑制剂时,Hep3B细胞MTOC阳性率在60%以上,其中DMSO组为62.76%,NaCl组为61.22%。而应用GSK-3β抑制剂后,MTOC阳性率明显下降,SB216763组降为31.17%,LiCl组降为29.09%。且具有统计学意义。结论:GSK-3β的活性被抑制后,不仅肝癌细胞迁移的速度被抑制,细胞的极性化也被打乱,影响了细胞迁移方向的决定,呈现出运动方向的随机化。