小麦全蚀病生防内生细菌及其抗菌活性物质的研究

论文摘要

由禾顶囊壳小麦变种Gaeumannomyces graminis （Sacc.） Arx & Olier var. tritici Walker（简称Ggt）引起的小麦全蚀病是小麦上的毁灭性病害之一,对农业生产造成了严重损失。由于缺乏抗性品种和有效、经济的化学药剂,而且轮作倒茬在小麦大面积种植地区受到了很大的限制,因此,生物防治成为防治小麦全蚀病的主要措施。然而,外界恶劣环境使许多生防菌剂效果不够稳定,因此筛选受环境因素影响小的生防因子是该病生物防治的关键。内生细菌具有生活在植物体内的独特优势,近几年在植物病害生物防治方面受到越来越多的重视,因此本研究通过温室盆栽试验从本实验室分离保存的小麦内生细菌中筛选出5株对小麦全蚀病具有良好防效的菌株,并对其中的EDR4菌株及其活性成份、防病效果以及细胞学机理进行了较为系统的研究,主要取得了以下结果:（1）在人工接种小麦全蚀病菌后,通过多批次温室盆栽幼苗试验从27株小麦内生细菌中筛选出5株防病效果较好且稳定的菌株,防效最高可达到57.3%,较对照药剂多菌灵防效高16.8%。进一步应用其发酵滤液、菌悬液的抑菌试验结果发现,5株生防细菌对全蚀病菌的菌丝生长均有明显的抑制作用,但各菌株的发酵滤液和菌悬液抑菌效果有明显差异,说明这些内生细菌的防病机理不尽相同。（2）通过三种方法施用EDR4利福平突变菌株,发现发酵原液灌根处理时定殖在小麦体内的平均菌体数量最多（23.54×103 cfu/g鲜组织）,叶面喷施次之,浸种处理最少（1.97×103 cfu/g鲜组织）,但在处理后一个月小麦体内平均的菌体定殖数量均有所下降。灌根处理有利于细菌在根组织定殖,十天后约为16.90×103 cfu/g鲜组织,在处理后一个月内呈增加趋势,而稀释2倍后发酵液灌根处理时根组织定殖的菌体数量明显少于原液。叶面喷施则有利于叶部定殖（22.59×103 cfu/g鲜组织）,说明不同使用方法、不同稀释度对生防细菌在小麦体内不同组织部位的定殖均有很大影响。（3）连续2年的田间小区防治试验结果表明,播种时沟施EDR4菌株,发现其对小麦全蚀病的防治效果在拔节期可达3550%,并且对小麦生长发育、产量形成有促进作用。（4）通过培养特性、形态学和生理生化特征以及16S rDNA序列分析将EDR4菌株鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。皿内抑菌试验发现EDR4菌株的抑菌谱较广,对12种常见植物病原真菌均有不同程度的抑制作用。（5）对EDR4菌株活性物质的研究发现,其发酵滤液经过硫酸铵盐析和浓缩,其30%饱和度盐析物和30%70%饱和度盐析物均有明显的抑菌活性,活性检测结果表明主要抗菌物质为蛋白类。进一步的摇瓶发酵条件优化结果表明,3mL EDR4菌株种子液接入装有50mL初始pH值为7的LB培养液中（250mL三角瓶）,28℃下150rpm培养48h,细菌生长量、蛋白总量以及抗菌蛋白的抑菌效果都可达到最佳。（6）通过硫酸铵盐析、疏水层析、阴离子交换层析和聚丙烯凝胶电泳等方法从EDR4菌株发酵滤液中纯化出了抗菌蛋白E2,检测发现其分子量约377kDa,pI值6.59,无蛋白酶抑制活性和β-1, 3葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶活性,但具有核糖核酸酶和凝血活性以及弱蛋白酶活性。比较发现E2蛋白性质与已知抗菌蛋白有很大差异,Q-TOF2质谱测序鉴定其为新蛋白,其对小麦全蚀病菌及其他6种常见植物病原真菌均有抑制作用。（7）光学和扫描电子显微镜观察结果发现,EDR4菌株处理小麦全蚀病菌后3d5d,菌落生长受到抑制,菌丝消解,内含物渗出,顶端膨大甚至死亡。透射电镜观察发现EDR4菌体出现在小麦根部组织内并且使病原菌细胞发生畸变,并且可诱导寄主细胞壁加厚和形成乳突等防卫反应,延缓病原菌扩展。（8）扫描和透射电子显微镜观察发现,EDR4菌株的E2蛋白可引起小麦全蚀病菌菌丝顶端膨大、菌丝干瘪、细胞内含物外渗、细胞壁加厚,细胞内形成新细胞壁、细胞质和细胞器降解等现象。以上结果可为该菌株及其抗菌蛋白的开发应用提供物质基础,并为进一步研究其抗菌机理奠定了理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 小麦全蚀病研究概况
• 1.1.1 小麦全蚀病的发生危害
• 1.1.2 小麦全蚀病的病原及发病规律
• 1.1.3 小麦全蚀病的防治研究进展
• 1.2 内生细菌及其应用研究概况
• 1.2.1 内生细菌的概念、分类及研究历史
• 1.2.2 内生细菌对植物的有益生物学作用
• 1.2.3 内生细菌在植物病害生物防治中的应用
• 1.3 内生细菌产活性物质的研究概况
• 1.3.1 内生细菌产活性物质的种类及其应用
• 1.3.2 内生细菌产抗菌活性物质的抑菌机理
• 1.4 选题的目的和意义
• 第二章 小麦全蚀病生防内生细菌的筛选
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 病原真菌及其接种体的制备
• 2.2.2 小麦内生细菌及其菌悬液的制备
• 2.2.3 内生细菌对小麦全蚀病的活体生测
• 2.2.4 内生细菌对小麦全蚀病菌菌落的抑制作用测定
• 2.2.5 内生细菌分泌物的活性检测
• 2.2.6 盆栽防治试验
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 活体生测筛选对小麦全蚀病有效果的内生细菌
• 2.3.2 内生细菌对靶标病原真菌菌落的抑制作用测定
• 2.3.3 内生细菌分泌物的活性检测
• 2.3.4 温室盆栽防治试验
• 2.4 讨论
• 第三章 生防细菌EDR4 在小麦体内的定殖及其对小麦全蚀病的田间防治效果
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 供试菌株及其培养
• 3.2.2 内生细菌EDR4 在小麦体内的定殖测定
• 3.2.3 田间小区试验
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 内生细菌在小麦体内的定殖情况
• 3.3.2 菌株EDR4 在田间小区对小麦全蚀病的防治效果
• 3.4 讨论
• 第四章 小麦内生细菌EDR4 的鉴定及其抗菌谱
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 供试菌株和培养基
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 菌株EDR4 的鉴定
• 4.2.4 菌株EDR4 对其他植物病原真菌生长的影响
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 菌株鉴定
• 4.3.2 菌株EDR4 的抗菌谱
• 4.4 讨论
• 第五章 生防菌株EDR4 抗菌蛋白的分离纯化及部分性质研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌株及其培养
• 5.2.2 主要试剂和仪器
• 5.2.3 菌株EDR4 产抗菌蛋白条件的优化
• 5.2.4 硫酸铵饱和度确定
• 5.2.5 抗菌蛋白E2 的纯化及其性质
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 抗菌蛋白产生条件的优化
• 5.3.2 盐析抗菌蛋白所用硫酸铵饱和度的确定
• 5.3.3 抗菌蛋白的纯化及部分性质
• 5.4 讨论
• 第六章 菌株EDR4 及其抗菌蛋白E2 抑菌防病的组织细胞学机理研究
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 供试菌株及其培养
• 6.2.2 小麦品种
• 6.2.3 内生细菌菌株EDR4 对不同植物病原真菌菌丝的抑制作用
• 6.2.4 荧光显微镜观察内生细菌对全蚀病菌侵入小麦根部的影响
• 6.2.5 电镜观察内生细菌对小麦全蚀病的抑菌防病作用
• 6.2.6 抗菌蛋白对小麦全蚀病菌的抑制作用
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 内生细菌菌株EDR4 对不同植物病原真菌菌丝的抑制作用
• 6.3.2 荧光显微镜观察细菌对全蚀病菌侵入小麦根部的影响
• 6.3.3 电镜观察内生细菌防治小麦全蚀病的组织细胞学
• 6.3.4 抗菌蛋白E2 对小麦全蚀病菌生长的影响
• 6.4 讨论
• 第七章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介