S2基因变异在中国马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱中作用的研究

论文摘要

基于已发表的马传染性贫血病毒（EIAV）S2基因与毒力有关报道,为揭示S2基因在中国EIAV弱毒疫苗致弱过程中的作用,探索该疫苗的致弱机理和免疫机制,本研究对我国马传染性贫血病毒弱毒疫苗传代过程中的代表性毒株（强毒株EIAVDV115、弱毒疫苗株EIAVDLV125,疫苗感染性克隆株vpFDD3-8）共22个S2基因及其编码的氨基酸序列进行分析发现,EIAV弱毒疫苗株S2基因的核苷酸序列与强毒株EIAVDV115之间有5个核苷酸的稳定突变,其中4个核苷酸的差异导致强毒株EIAVDV115与弱毒株间发生了4个氨基酸改变,其中Q-K的改变位于S2与Env的重叠区。为此,本研究以弱毒疫苗株全基因组感染性克隆质粒pFDD3-8为模板,以疫苗研制过程中强毒株EIAVDV115与弱毒疫苗株之间氨基酸的差异为依据,按照编码差异氨基酸的核苷酸的不同组合,构建了6株将S2基因不同差异位点回复突变至强毒株相应序列的全基因组感染性克隆质粒。经在体外转染驴胎皮肤细胞（FDD）中继代盲传至第3代时,转染6株EIAV克隆质粒的FDD细胞单层可见与亲本疫苗株克隆质粒相似的细胞病变（CPE）,同时可在FDD细胞培养物的上清液中检测到EIAV逆转录（RT）酶活性。此外,细胞培养物经间接免疫荧光和RT-PCR检测均呈EIAV阳性,在电镜下可观察到典型EIAV粒子。上述结果证明本研究已成功拯救出6株EIAV S2基因不同差异位点回复突变全基因组感染性克隆的衍生病毒（vpFDS2r1-3-4-5、vpFDS2r3-4、vpFDS2r1-3-4、vpFDS2r3-4-5、vpFDS2r1和vpFDS2r5）,以及亲本疫苗株全基因组感染性克隆的衍生病毒vpFDD3-8。以病毒RT酶活性为检测指标,对6株S2基因不同差异位点回复突变克隆衍生病毒和vpFDD3-8在体外培养的马外周血单核巨噬细胞（EMDM）和FDD细胞中的复制动力学进行了分析。结果表明,6株S2基因回复突变克隆衍生病毒与vpFDD3-8在以上2种细胞中具有相似的复制特性。除vpFDS2r3-4-5外,5株S2基因回复突变克隆衍生病毒在FDD细胞上的复制显著低于亲本vpFDD3-8（p<0.01）。相反,在EMDM细胞中,只有S2基因4点回复突变克隆衍生病毒（vpFDS2r1-3-4-5）的复制明显滞后于vpFDD3-8（p<0.05）。应用兔抗EIAV S2蛋白多克隆抗体进行S2蛋白检测,发现6株S2基因回复突变克隆衍生病毒和vpFDD3-8均能在体外培养的FDD细胞内正确表达S2蛋白。体外试验数据说明,与vpFDD3-8相比,S2基因回复突变为强毒EIAVDV115的相关基因,对衍生病毒在FDD细胞中的复制有明显抑制,而在EMDM中,只有4点回复突变衍生病毒vpFDS2r1-3-4-5的复制水平显著降低。由于EIAV在马体内的主要靶细胞是EMDM,选择了最能代表S2基因回复突变的体外生物学特性的衍生病毒vpFDS2r1-3-4-5,以及亲本疫苗株衍生病毒vpFDD3-8进行动物接种试验,将12匹EIAV阴性健康马分为3组,第1组（15#、28#、31#和34#）接种vpFDD3-8,第2组（3#、4#、8#和35#）接种vpFDS2r1-3-4-5,同时设第3组（27#、33#、37#和38#）作为非接种病毒对照组。经对试验马匹的体温、血小板数量、血浆病毒载量等进行动态跟踪研究,结果显示,在101d的观察期内,第2组接种vpFDS2r1-3-4-5的马匹均出现1次或2次体温升高,以及伴随的血小板数量降低和病毒载量上升等症状,但血小板数量的降低和病毒载量的上升均低于典型的EIA临界值,而接种vpFDD3-8的第1组和健康对照组的试验马匹没有出现与EIA相似的症状。应用兔抗EIAVS2蛋白多克隆抗体进行S2蛋白检测,发现vpFDS2r1-3-4-5和vpFDD3-8均能在接种的马体内正确表达S2蛋白。经马体内试验数据的统计学分析显示,vpFDS2r1-3-4-5接种马匹病毒载量明显高于vpFDD3-8（p<0.01）,而这种升高主要发生在接种后第23-46d。此外,vpFDS2r1-3-4-5接种马匹的病毒载量升高与血小板数量降低之间、体温升高与病毒载量升高之间,以及体温升高与血小板数量降低之间均具有极显著的相关性（p<0.01）。以上结果表明:1)S2基因突变是影响中国EIAV弱毒株体内复制水平下降的重要原因之一,但并非决定性因素。2)S2基因突变可通过影响病毒复制能力对病毒的毒力产生影响,因此S2基因是影响中国EIAV疫苗株毒力弱化特性的重要因素之一。3)S2基因逆向突变导致弱毒疫苗株在宿主体内复制水平的提高,但并不能使中国EIAV弱毒疫苗株恢复亲本强毒株特性。这表明,在单一基因发生逆向突变的情况下,弱毒疫苗株仍保持其弱化特性,进一步支持了中国EIAV弱毒疫苗株的生物安全性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 EIAV 的归属与分类
• 1.2 EIAV 的核酸组成及编码蛋白
• 1.2.1 EIAV 的结构蛋白
• 1.2.2 EIAV 的LTR 功能
• 1.2.3 EIAV 的附加蛋白
• 1.3 EIAV 引起疾病的临床特征
• 1.3.1 EIAV 感染的控制
• 1.3.2 EIA 的发病进程
• 1.3.3 EIA 的生理病理学变化
• 1.3.4 EIAV 的细胞嗜性与病毒毒株
• 1.4 EIAV 在感染动物体内的演化
• 1.5 EIAV 感染和复制的免疫控制
• 1.6 EIAV 的疫苗研制
• 1.7 本试验的目的和意义
• 第二章 EIAV 疫苗株 S2 基因不同差异位点回复突变全基因组感染性克隆的构建
• 2.1 材料
• 2.1.1 毒株、菌株与质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 细胞
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 仪器设备
• 2.1.6 引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 序列分析
• 2.2.2.1 S2 氨基酸序列分析与系统进化树构建
• 2.2.2.2 国内强弱毒EIAV S2 基因的序列分析
• FDDV S2 基因不同差异位点突变质粒的构建'>2.2.3 EIAV_FDDV S2 基因不同差异位点突变质粒的构建
• FDDV S2 基因不同差异位点回复突变全基因组克隆质粒的构建'>2.2.4 EIAV_FDDV S2 基因不同差异位点回复突变全基因组克隆质粒的构建
• 2.2.5 质粒转染与病毒传代
• 2.2.6 转染后FDD 细胞内盲传
• 2.2.7 衍生病毒在 EMDM 细胞内盲传
• 2.2.8 验证拯救病毒试验
• 2.2.8.1 RT-PCR 检测
• 2.2.8.2 间接免疫荧光试验
• 2.2.8.3 逆转录酶活性检测
• 2.2.8.4 衍生病毒电镜观察
• 2.2.9 衍生病毒复制动力学分析
• 2.2.9.1 FDD 细胞内衍生病毒复制活性检测
• 2.2.9.2 EMDM 内衍生病毒复制活性检测
• 2.2.9.3 Western blot 检测衍生病毒体外S2 蛋白表达
• 2.3 结果
• 2.3.1 序列分析结果
• 2.3.1.1 S2 氨基酸序列分析与系统进化树构建
• 3.3.1.2 国内强弱毒EIAV S2 基因的序列分析
• FDDV S2 基因不同差异位点突变质粒的构建'>2.3.2 EIAV_FDDV S2 基因不同差异位点突变质粒的构建
• FDDV S2 基因不同差异位点回复突变全基因组克隆质粒的构建'>2.3.3 EIAV_FDDV S2 基因不同差异位点回复突变全基因组克隆质粒的构建
• 2.3.4 转染和FDD 细胞病变
• 2.3.5 转染和FDD 细胞病变
• 2.3.6 重组质粒测序和RT-PCR 鉴定
• 3.3.7 间接免疫荧光试验
• 2.3.8 逆转录酶活性检测
• 2.3.9 衍生病毒电镜观察
• 2.3.10 病毒的复制动力学分析
• 2.3.10.1 衍生病毒在FDD 细胞中的复制特性
• 2.3.10.2 衍生病毒在EMDM 中的复制特性
• 2.3.10.3 Western blot 检测衍生病毒S2 蛋白表达
• 2.4 讨论
• 第三章 EIAV 疫苗株 S2 基因回复突变全基因组感染性克隆衍生病毒的马体内试验
• 3.1 材料
• 3.1.1 毒种
• 3.1.2 实验动物
• 3.1.3 试剂
• 3.1.4 仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 Realtime RT-PCR 标准曲线的建立
• 3.2.1.1 EIAV gag 部分基因的扩增与克隆
• 3.2.2.2 EIAV gag 部分基因的体外转录
• 3.2.2.3 体外转录产物的纯化
• 3.2.2.4 标准曲线建立
• 3.2.2 EIAV S2 基因回复突变型衍生病毒的定量
• 3.2.3 试验分组与接种病毒情况
• 3.2.4 样品采集
• 3.2.5 马血液分析
• 3.2.6 血浆中病毒RNA 提取
• 3.2.7 马体内S2 及部分gp90 的序列分析
• 3.2.8 试验马体温及血常规检测
• 3.2.9 马体内EIAV 载量的测定
• 3.2.10 马体内衍生病毒S2 蛋白表达检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 Realtime RT-PCR 标准曲线的建立
• 3.3.2 EIAV S2 基因回复突变型衍生病毒的定量
• 3.3.3 马体内S2 及部分gp90 的序列分析
• 3.3.4 试验马临床体征及病毒毒力指标分析
• 3.3.4.1 亲本疫苗株克隆衍生病毒对照组的体温、血小板与病毒载量动态分析
• 3.3.4.2 S2 基因回复突变克隆衍生病毒组的体温、血小板与病毒载量动态分析
• 3.3.4.3 健康对照组的体温、血小板与病毒载量动态分析
• 3.3.4.4 体内试验数据统计学分析
• 3.3.5 马体内衍生病毒 S2 蛋白表达检测
• 3.4 讨论
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历