人表皮生长因子的偏爱性表达及生化药理性质

论文题目: 人表皮生长因子的偏爱性表达及生化药理性质

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 智庆文

导师: 李仕贵,孙曼霁

关键词: 番茄,胃溃疡,人表皮生长因子,融合蛋白,融合蛋白

文献来源: 四川农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 人表皮生长因子(human epidermal growth factor,hEGF)是人体内一种十分重要的多肽类生长因子,微量的hEGF能强烈地促进细胞的分裂和生长。hEGF在保护消化道上皮细胞及修复粘膜细胞中发挥巨大作用。hEGF分泌不足的人群容易发生口腔、食道、胃及十二指肠溃疡。目前临床上应用的治疗溃疡的药物疗效显著,但在一部分患者中,溃疡愈合不够完美,形成所谓的红疤(red scar),更有甚者在服药1年后仍不能愈合。对此类病人联合服用hEGF却能收到理想的治疗效果。hEGF转基因番茄口味香甜,易种植,产量高,作为上消化道保健及溃疡防治食品药物有良好的前景。 根据番茄偏爱的密码子合成了能在植物中表达的基因序列。实验证明该基因能在番茄中表达,也能在大肠杆菌中高效融合表达,表达产物有良好的生物活性。本研究的主要结果如下: 1 依据番茄密码子的偏爱性,设计并人工合成了hEGF基因序列; 2 构建了p2300-35S-hEGF和p2300-2A11-hEGF两个植物表达载体; 3 建立了樱桃番茄cg2001-14的遗传转化体系; 4 分子检测证明hEGF基因成功整合到番茄的基因组中; 5 放射免疫法检测证明hEGF在转基因果实中成功表达; 6 转基因番茄对酒精引起的急性胃溃疡模型动物有明显的防治效果; 7 构建了pGEX-4T-1-hEGF表达载体,实现了GST-hEGF融合蛋白在原核生物中的高效表达。纯化得到具有生物活性的、高纯度的目的蛋白; 8 构建了pPTD-hEGF表达载体。实现了融合蛋白PTD-hEGF在原核生物中的高效表达。纯化得到纯度较高的目的蛋白,PTD可引领hEGF穿过细胞膜进入细胞内,表现出了良好的生物活性。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

缩略词表

第一部分 文献综述

1． 表皮生长因子研究进展

1．1 EGF的组成及分子结构

1．2 EGF的合成与分布

1．3 EGF受体

1．3．1 EGFR的结构

1．3．2 EGFR的分布

1．3．3 EGFR活化与信号转导机制

1．4 EGF的生物学效应及临床应用

1．4．1 促上皮细胞生长的作用

1．4．2 抗细胞衰老的作用

1．4．3 促血管生成的作用

1．4．4 促肿瘤生长的作用

1．4．5 促肝损伤修复和再生的作用

1．4．6 保护呼吸系统的作用

1．4．7 刺激生殖系统的作用

1．4．8 促进角膜等眼组织生长的作用

1．4．9 在神经系统中的作用

1．4．10 对消化系统的作用及临床应用

1．5 EGF对皮肤的作用

1．5．1 对细胞周期的作用

1．5．2 维护皮肤细胞外基质的作用

1．5．3 促进皮肤毛细血管的生成

1．5．4 促进细胞存活

1．5．5 延缓皮肤衰老的作用

1．5．6 对皮肤癌的抑制作用

2． 转基因番茄研究进展

2．1 转基因延熟番茄的研究

2．1．1 抑制番茄细胞壁降解的研究

2．1．2 抑制番茄乙烯合成的研究

2．2 转基因抗病番茄的研究

2．2．1 番茄抗病毒病基因工程

2．2．2 番茄抗真菌及细菌病基因工程

2．3 番茄抗虫基因工程

2．4 番茄抗除草剂基因工程

2．5 番茄抗逆基因工程

2．6 番茄品质改良的研究

2．7 延缓番茄叶衰老的转基因研究

2．8 番茄雄性不育基因工程研究

2．9 利用番茄作为生物反应器

2．10 番茄基因工程展望

3． 开题设想

第二部分 人表皮生长因子转基因番茄

Ⅰ 实验材料与方法

1 实验材料

1．1 番茄品系

1．2 动物品系

1．3 质粒与菌株

1．4 酶和试剂

1．5 主要仪器和设备

1．6 细菌培养基

1．7 植物组织培养培养基配制

1．8 主要溶液

2 实验方法

2．1 番茄偏爱型hEGF基因的设计及合成

2．2 植物表达载体的构建

2．2．1 质粒小量提取

2．2．2 质粒 DNA的限制性酶切

2．2．3 重组质粒的连接

2．2．4 感受态细菌的制备

2．2．5 质粒的转化

2．2．6 重组质粒的筛选与鉴定

2．2．7 PCR克隆

2．3 番茄的转化及再生

2．3．1 番茄无菌苗的培养

2．3．2 外植体的获得及处理

2．3．3 工程菌的获得及活化

2．3．4 外植体的转化

2．3．5 筛选及分化培养

2．3．6 生根培养

2．3．7 温室移栽

2．3．8 再生植株的生长、开花和结果

2．4 再生植株的分子检测

2．4．1 植物基因组 DNA的小量快速提取

2．4．2 CTAB法大量提取植物基因组 DNA

2．4．3 聚合酶链式反应(PCR)检测

2．4．4 PCR Southern blotting分析

2．5 番茄果实中目的蛋白表达量的测定

2．5．1 果实中蛋白质的提取

2．5．2 放射免疫法测定蛋白质的含量

2．5．3 不同条件下的稳定性实验

2．6 表达产物对实验动物急性胃溃疡的防治

2．6．1 hEGF对实验动物胃粘膜的保护作用

2．6．2 hEGF对胃溃疡模型动物的治疗作用

Ⅱ 实验结果与分析

1． 番茄偏爱型hEGF基因的设计及合成

2． p2300-35S-hEGF表达载体的构建

2．1 含hEGF目的基因片段的获取

2．2 在目的基因的3’端添加 NOS终止子序列

2．3 在目的基因的5’端添加 CaMV35S启动子

2．4 hEGF基因表达盒与载体pCAMBIA2300的连接

3． p2300-2A11-hEGF表达载体的构建

3．1 2A11启动子的获得

3．2 2A11与pGEM-T Vector连接鉴定

3．3 2A11启动子更换p2300-35S-hEGF中的 CaMV35S启动子

4． 番茄的转化及植株再生

4．1 不同基因型材料对愈伤组织诱导的影响

4．2 激素对愈伤组织诱导的影响

4．3 不同工程菌对诱导愈伤的影响

4．4 转基因植株的获得

5． 再生植株的分子鉴定

5．1 再生当代植株的基因组 DNA提取

5．2 再生当代植株的 PCR分析

5．2．1 以 LBA4404为工程菌的转化情况

5．2．2 以 C58为工程菌的转化情况

5．3 再生当代植株的 PCR-Southern分析

5．4 再生当代植株的 PCR产物测序鉴定

5．5 T1代植株 PCR及 PCR-Southern检测

5．6 T2代植株 PCR检测

6． 番茄果实中目的蛋白表达量的测定

6．1 转 LBA4404/p2300-35S-hEGF番茄中hEGF的含量

6．2 转 LBA4404/p2300-2A11-hEGF番茄中hEGF的含量

6．3 转 C58/p2300-2A11-hEGF番茄中hEGF的含量

7． 表达产物稳定性分析

8． 对实验动物急性胃溃疡的防治

8．1 转p2300-35S-hEGF果实对实验动物的胃粘膜保护作用

8．2 转p2300-2A11-hEGF果实对实验动物胃粘膜的保护作用

8．3 转p2300-2A11-hEGF果实对实验动物胃溃疡的治疗作用

Ⅲ 讨论与结论

1 讨论

1．1 番茄再生体系的建立

1．2 不同启动子在外源蛋白表达上的影响

1．3 PCR产物测序的应用

1．4 转基因当代外源蛋白的表达情况

1．5 转基因后代植株基因沉默的可能原因分析

1．6 转基因番茄抵抗酒精引起的胃溃疡的机制探讨

2 结论

第三部分 人 EGF融合蛋白的原核表达

Ⅰ 实验背景及目的

Ⅱ 材料与方法

1 实验材料

1．1 菌株和质粒

1．2 酶和试剂

1．3 实验细胞

1．4 动物品系

1．5 主要仪器设备

1．6 主要溶液与培养基

2 实验方法

2．1 pGEX-4T-1-hEGF表达载体的构建

2．2 重组表达载体pGEX-4T-1-hEGF的鉴定

2．2．1 PCR鉴定

2．2．2 酶切鉴定

2．3 重组 GST-hEGF基因在大肠杆菌中的诱导表达

2．4 表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测

2．5 表达产物的Western blotting实验

2．6 hEGF融合蛋白表达形式的确定

2．7 重组 GST-hEGF融合蛋白的纯化

2．8 pPTD-hEGF表达载体的构建

2．8．1 PCR引物的设计

2．8．2 目的基因的克隆

2．8．3 目的基因与pGEM一T载体的连接

2．8．4 pPTD-hEGF重组表达载体的构建

2．8．5 对重组表达载体鉴定

2．9 PTD-hEGF融合表达产物的 MALDI-TOF-MS分析

2．10 重组 PTD-hEGF融合蛋白的分离纯化

2．11 纯化液中hEGF融合蛋白含量的测定

2．12 细胞水平上测定融合蛋白的生物活性

2．12．1 细胞培养

2．12．2 MTS检测法

2．12．3 皮下注射融合蛋白对新生小鼠的作用

2．12．4 口服融合蛋白对新生小鼠的作用

Ⅲ 实验结果与分析

1． 重组表达载体pGEX-4T-1-hEGF的构建

1．1 含hEGF目的基因片段的获得

1．2 目的载体片段的获得

1．3 重组质粒的鉴定

1．3．1 PCR鉴定

1．3．2 BamH I和 EcoR I双酶切鉴定

2． 重组工程菌的获得与鉴定

3． 工程菌的诱导表达

4． Western blotting检测表达蛋白

5． hEGF融合蛋白表达形式的确定

6． pPTD-hEGF表达载体的构建

6．1 目的基因的克隆

6．2 pGEM-hEGF中间表达载体的构建

6．2．1 质粒电泳鉴定

6．2．2 重组质粒的 PCR鉴定

6．3 含 Kpn I和 EcoR I hEGF基因片段的获得

6．4 目的载体片段的获得

6．5 重组表达载体pPTD-hEGF鉴定

7． PTD-hEGF融合蛋白的表达

8． 重组蛋白表达形式的分析

9． Western blotting分析

10． MALDI-TOF-MS分析 PTD-hEGF融合蛋白

11． 重组hEGF融合蛋白的亲合层析纯化

11．1 GST-hEGF亲和层析纯化

11．2 PTD-hEGF融合蛋白的纯化

12． 洗脱液中目的蛋白含量的测定

13． 重组 GST-hEGF融合蛋白的促细胞增殖活性

14． 重组 PTD-hEGF融合蛋白的促细胞增殖活性

15． 皮下注射hEGF融合蛋白对新生小鼠的影响

16． 口服hEGF融合蛋白对新生小鼠的影响

Ⅳ 讨论与结论

1 讨论

1．1 GST-hEGF融合蛋白的表达及活性

1．2 PTD-hEGF融合蛋白的表达及活性

1．3 重组hEGF融合蛋白的生化药理性质

1．3．1 血清对细胞生长和rhEGF生物活性检测的影响

1．3．2 酶解程度对rhEGF生物活性检测的影响

1．3．3 细胞传代培养时间对rhEGF生物活性检测的影响

1．3．4 细胞浓度对检测的影响

2 结论

第四部分 论文总结

参考文献

在读期间发表论文及申请专利情况

致谢

发布时间: 2005-10-27

参考文献

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