以人伤寒沙门菌Ty21a菌蜕为基础的新型HIV核酸疫苗研究

论文摘要

艾滋病是对人类健康的巨大威胁,已成为严重的社会公共卫生问题。大力开展艾滋病的防治是全世界面临的紧迫任务。经过20多年艰苦卓绝的研究工作,抗HIV药物已取得了很大进展,艾滋病疫苗研究虽未取得预期的成功,但近年来也取得了一些令人鼓舞的进展。如2009年在泰国进行的大规模艾滋病疫苗试验表明:与未接种疫苗者相比,接种艾滋病疫苗人群HIV-1的感染风险减少超过31%。这表明有效的HIV疫苗仍然可以成为控制HIV流行的有效手段。DNA疫苗可有效诱导细胞免疫、体液免疫及黏膜免疫应答,是HIV疫苗发展的重要策略之一。采用DNA疫苗初免并结合其它形式的疫苗进行加强免疫的免疫策略（Priming-Boost策略）是HIV疫苗发展的最主要的策略之一。但是DNA疫苗目前仍存在免疫原性较低、免疫剂量较大等问题。为了有效增强DNA疫苗的免疫原性,本研究以人伤寒沙门菌Ty21a菌蜕作为疫苗递送载体,以HIV-1 Env gp140作为模式免疫原,构建以菌蜕为基础的新型HIV核酸疫苗,并采用Priming-Boost策略用重组蛋白疫苗或重组活病毒载体疫苗进行加强免疫,开展了以人伤寒沙门菌Ty21a菌蜕为基础的新型HIV核酸疫苗研究。1、人伤寒沙门菌Ty21a菌蜕的制备及其生物学特征分析（1）人伤寒沙门菌Ty21a的转化条件优化:本研究采用电击转化方法将表达噬菌体E蛋白的裂解质粒pMBE转化入人伤寒沙门菌Ty21a,通过不同的电击电压的选择,最终确定最佳转化条件。结果显示,电压1 KV时,细胞大量死亡;电压250V和500 V时,均能实现质粒转化,然而后者转化效率稍高于前者,二者无显著差异。电压500 V、电阻200Ω、电容25μF是Ty21a菌的最佳电击转化条件。（2）人伤寒沙门菌Ty21a菌蜕的制备:重组Ty21a菌（pMBE）在28℃培养至对数生长中期,将培养物分为两份。一份温度迅速升至42℃诱导细菌裂解,另一份于28℃继续培养作为对照。结果显示,42℃诱导后1h,Ty21a菌已开始裂解,在4h时裂解最充分。菌落计数结果可得重组Ty21a菌（pMBE）裂解前的菌液CFU为90×105,而裂解后的菌液CFU为3×105,裂解效率达96.77%。（3）人伤寒沙门菌Ty21a菌蜕的鉴定:采用电镜观察和细菌培养技术对Ty21a菌蜕进行形态学特征和存活率分析。结果表明,Ty21a菌在诱导后形成菌蜕,呈空泡状结构,并能看到溶菌孔道,直径介于200400 nm之间。菌蜕保留了完整的细菌外膜,但因为胞内物质被释放出去,细菌发生明显皱缩。Ty21a菌在经过E裂解蛋白的诱导裂解以及随后的冻干处理后,Ty21a菌全部失活。（4）人伤寒沙门菌Ty21a菌蜕的装载效率分析:以绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-N1进行Ty21a菌蜕装载条件的优化,并在此基础上利用小鼠巨噬细胞系RAW264.7进行了体外转染实验。结果显示,装载温度和装载时间的不同对菌蜕装载效率无显著影响,而菌蜕装载DNA效率与质粒浓度呈正相关;平均每个菌蜕装载103104拷贝质粒,具有较高的装载效率。体外转染实验表明,Ty21a菌蜕可被巨噬细胞RAW264.7有效吞噬,从而有效摄取质粒pEGFP-N1,并在细胞内实现绿色荧光蛋白的表达。表明了Ty21a菌蜕作为一种新型的DNA疫苗递送载体,不但装载效率高,还可有效靶向质粒DNA到抗原递呈细胞,实现目的抗原的表达。2、Ty21a菌蜕型HIV DNA疫苗不同免疫方式及免疫效果研究（1） Ty21a菌蜕型HIV DNA疫苗的制备:按照优化的Ty21a菌蜕装载条件,进行HIV DNA疫苗pSV140质粒的装载,制备了Ty21a菌蜕型HIV DNA疫苗（以下简称“Ty21aBG（DNA）疫苗”）,并进行了体外转染实验。体外转染实验结果表明,Ty21a菌蜕可有效介导HIV DNA疫苗递呈到巨噬细胞RAW264.7,并实现目的抗原的有效表达。（2） Ty21a菌蜕型HIV DNA疫苗皮下途径诱导小鼠免疫效果分析:Ty21aBG（DNA）疫苗皮下途径免疫BALB/c小鼠,并于末次免疫后第10天进行血清gp120特异性IgG抗体、小肠灌洗液sIgA抗体和胞内细胞因子流式细胞检测。血清gp120特异性IgG抗体检测结果表明,与裸DNA疫苗相比,Ty21aBG（DNA）疫苗可诱导机体产生高效价IgG抗体,并且IgG1抗体水平高于IgG2a,提示Ty21aBG（DNA）疫苗诱导了Th1/Th2平衡的免疫应答,初步说明Ty21a菌蜕可有效弥补DNA疫苗诱导的体液免疫水平低的不足。小肠灌洗液sIgA抗体检测结果表明,Ty21aBG（DNA）疫苗可有效诱导小鼠产生黏膜免疫应答。胞内细胞因子流式细胞检测结果表明,Ty21aBG（DNA）疫苗可诱导机体产生细胞免疫应答。为了进一步分析Ty21aBG（DNA）疫苗增强体液免疫应答水平的原因,以小鼠巨噬细胞系RAW264.7作为体外模型,以BALB/c小鼠作为体内模型,进行了免疫机制研究。结果表明,与裸DNA疫苗组相比,无论RAW264.7细胞或BALB/c小鼠,在接种Ty21aBG（DNA）的早期,血清IFN-γ和IL-12细胞因子的分泌水平无显著增强,而IL-10细胞因子分泌水平显著升高（P<0.01）。表明Ty21aBG（DNA）疫苗能显著增强机体Th2型免疫应答,从而增强了DNA疫苗所诱导体液免疫应答能力,实现了体液免疫应答和细胞免疫应答的平衡。（3） Ty21a菌蜕型HIV DNA疫苗肌肉途径诱导小鼠免疫效果分析:Ty21aBG（DNA）疫苗肌肉途径免疫BALB/c小鼠,并于末次免疫后第10天进行血清gp120特异性总IgG抗体和亚类检测。结果表明,与裸DNA疫苗相比,Ty21aBG（DNA）疫苗肌肉途径免疫BALB/c小鼠,可有效诱导机体产生特异性免疫应答。IgG抗体的亚类分析结果说明,Ty21aBG（DNA）疫苗能诱导机体Th1/Th2平衡的免疫应答;并且IgG1抗体水平高于IgG2a抗体,提示了Ty21aBG（DNA）疫苗能增强Th2型免疫应答。（4） Ty21a菌蜕型HIV DNA疫苗局部黏膜途径诱导小鼠免疫效果分析:为了分析Ty21aBG（DNA）疫苗能否通过局部黏膜途径诱导机体产生有效的免疫应答,本研究选择了两种常规黏膜途径—灌胃免疫和滴鼻免疫途径,进行此疫苗诱导BALB/c小鼠免疫效果分析,并于末次免疫后第10天进行血清gp120特异性总IgG抗体和亚类检测。结果表明,与裸DNA疫苗相比,Ty21aBG（DNA）疫苗黏膜途径免疫BALB/c小鼠,可有效诱导机体产生高效价的IgG抗体（P<0.05）,说明了Ty21aBG（DNA）疫苗经黏膜免疫可有效诱导机体产生特异性免疫应答。3、Ty21a菌蜕型HIV DNA疫苗与其他形式HIV疫苗联合免疫实验研究（1） Ty21a菌蜕型HIV DNA疫苗与重组蛋白疫苗联合免疫的免疫效果分析: Ty21a菌蜕型HIV DNA疫苗皮下途径进行初次免疫,Ty21a菌蜕型gp120蛋白疫苗（以下简称“Ty21aBG （gp120）蛋白疫苗”）肌肉途径进行加强免疫,开展了此疫苗诱导小鼠的免疫效果分析。结果表明,Ty21aBG （gp120）蛋白疫苗加免,无需佐剂,便可有效诱导小鼠产生特异性免疫应答。进一步分析,此疫苗策略可同时诱导小鼠产生gp120/Thai B和gp120/CRF01AE两种抗原特异性的血清IgG抗体,与单纯Ty21aBG（DNA）疫苗策略相比,gp120/Thai B特异性IgG抗体效价无显著差异,而gp120/CRF01AE特异性IgG抗体效价则有显著升高,揭示了Ty21a菌蜕型HIV DNA疫苗与重组蛋白疫苗联合免疫策略可显著增强DNA疫苗所诱导体液免疫应答能力。（2）Ty21a菌蜕型HIV DNA疫苗与重组活病毒疫苗联合免疫的免疫效果分析:Ty21a菌蜕型HIV DNA疫苗皮下途径进行初次免疫,重组MVTT活病毒疫苗肌肉途径进行加强免疫,开展了此疫苗诱导小鼠的免疫效果分析。结果表明,重组MVTT活病毒疫苗加强免疫,可有效诱导小鼠产生特异性免疫应答;诱导小鼠产生的血清IgG类型以IgG2a为主,说明Ty21a菌蜕型HIV DNA疫苗与重组活病毒疫苗联合免疫策略可诱导Th1/Th2免疫应答,并且能增强Th1型免疫应答,从而有效诱导机体产生细胞免疫应答,实现了体液和细胞免疫应答的平衡。4、结论利用噬菌体PhiX174 E裂解蛋白成功制备具有完整胞膜结构的人伤寒沙门菌Ty21a菌蜕;Ty21a菌蜕作为一种新型DNA疫苗递送载体,能有效靶向DNA疫苗到抗原递呈细胞,并实现目的抗原的有效表达。Ty21a菌蜕型HIV DNA疫苗经皮下途径和肌肉途径免疫小鼠,无需佐剂,可有效诱导小鼠产生特异性免疫应答。Ty21a菌蜕型HIV DNA疫苗不但能通过系统免疫途径,还能通过局部黏膜免疫途径（滴鼻途径和灌胃途径）诱导小鼠产生特异性免疫应答。Ty21a菌蜕型HIV DNA疫苗与其他形式HIV疫苗如重组蛋白疫苗或重组活病毒疫苗进行联合免疫,可显著增强小鼠特异性免疫应答水平。因此,Ty21a菌蜕型HIV DNA疫苗是一种非常有前景的HIV候选疫苗。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 人伤寒沙门菌Ty21a菌蜕的制备及其生物学特征分析
• 引言
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 第二部分 Ty21a菌蜕型HIV DNA疫苗不同免疫方式及免疫效果研究
• 引言
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 第三部分 Ty21a菌蜕型HIV DNA疫苗与其它形式HIV疫苗联合免疫实验研究
• 引言
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 总结
• 参考文献
• 附录
• 文献综述
• 发表文章
• 个人简历
• 致谢