论文摘要
目的：1.构建创伤性DVT大鼠模型,采用基因芯片技术检测大鼠股静脉组织基因表达变化,针对血栓形成前、血栓形成高峰期、高峰期血栓不形成等关键状态,筛选出显著差异表达的基质金属蛋白酶-3、-9（Matrix Metalloproteinase-3、-9,MMP-3、-9）等基因,研究MMP-3、MMP-9表达变化及其内在规律性；2.检测创伤性DVT大鼠血中MMP-3、MMP-9在各组中的表达变化及与人BLAST同源性比对,研究其与创伤性DVT形成相关性及与人类同源性；3.检测、分析创伤性DVT人血中MMP-3、MMP-9在各组中的表达变化,探讨其在创伤性DVT发生、发展过程中可能发挥的作用。方法：本研究分为三个部分：第一部分：建立创伤性DVT大鼠模型,基因芯片检测大鼠股静脉组织基因表达变化,采用倍数变化分析法（Fold Change,FC）筛选出差异表达基因2458个其中上调1146个；下调1312个。设定参数Single Log2 ratio=4,D组和G组=100,筛选出MMP-3、MMP-9、IL-18等51个显著差异表达的基因。查阅相关文献,选择MMP-3、MMP-9基因作为研究对象。第二部分：再次构建创伤性DVT模型,将100只SD大鼠根据观察时间和血栓形成情况进行如下分组：正常对照组（A组,n=10）、血栓形成初始期（B组,n=20）,血栓形成高峰期（C组,n=20）和高峰期无血栓形成组（D组,n=20）。提取各组血液总RNA并检测质量,设计RT-PCR反转录引物,将各组大鼠血液总RNA反转录为cDNA,RT-PCR检测各组大鼠血细胞中MMP-3、MMP-9的表达变化；ELISA检测MMP-3、MMP-9的表达量。再通过NCBI GenBank数据库和CNKI数据库,将两者的基因序列代入BLAST中进行比较,明确MMP-3、MMP-9在大鼠与人类之间的同源性（序列比对使用MEGA4.0软件）。第三部分：在临床,制定统一观察、诊断标准及纳入和排除标准,根据制定的标准专人收集临床资料。实验分组：正常对照组（A组,n=10）、血栓形成组（B组,n=10）,血栓不形成组（C组,n=10）。收集血样本,ELISA检测MMP-3、MMP-9的表达量；以GAPDH为内参照,real-time PCR检测各组大鼠血细胞中MMP-3、MMP-9的表达量。结果：1.基因芯片检测创伤性DVT大鼠股静脉组织显示：共有15864个基因,差异表达基因2458个,其中上调1146个,占差异表达基因总数46.6%；下调1312个,占差异表达基因总数的53.4%。设定参数,筛选出MMP-3、MMP-9基因作为进一步研究对象。2. RT-PCR和ELISA检测创伤性DVT大鼠血细胞中MMP-3、MMP-9的表达量显示：在血栓形成即刻组MMP-3、MMP-9开始呈轻度高表达,在血栓形成高峰期（C组）呈显著高表达,而在血栓不形成组（D组）呈轻度高表达,C组与D组统计学比较有显著性差异,该验证结果与基因芯片检测结果具有高度一致性；BLAST同源性比对显示：MMP-3、MMP-9在大鼠与人类之间的同源性较高。3. Real-time PCR和ELISA检测创伤性DVT人血中MMP-3、MMP-9的表达量显示：MMP-3、MMP-9在血栓形成组（B组）24h含量含量逐渐增高,72h到高峰,120h和168h维持在高峰水平；血栓不形成组（C组）组24h含量略增高,72h达到高峰,而120h和168h逐渐下降。B组和C组统计学比较有显著性差异。该验证结果与基因芯片检测结果也具有高度一致性。结论：1.将快速、准确、高通量及适用于大范围基因表达筛查的基因芯片技术与适合于重点基因、蛋白检测的real-time PCR和ELISA技术相结合研究DVT是一种很好的优势互补的研究方法。2.大鼠股静脉血管壁组织、血液中和人血液中,MMP-3、MMP-9表达上调与创伤性DVT形成高度相关。3.MMP-3、MMP-9与创伤性DVT之间存在密切相关性,可能是影响深静脉血栓生物学状态的主要因素之一