论文摘要
大豆（Glycine max L．）是世界上重要的粮食和油料作物，是植物蛋白质的主要来源。真菌性病害是导致大豆品质和产量下降的重要原因，其中大豆灰斑病、疫霉根腐病、霜霉病等最为严重，每年都会造成不同程度损失，在病害大流行年份可造成严重损失甚至绝产。为了提高大豆的产量和品质，培育抗病品种是目前生产上亟待解决的重要问题。然而传统的抗病育种手段工作量大、周期长、效率低，不能满足农业生产的需要。因此，将传统育种和生物技术结合起来进行分子育种势在必行。近年来，随着分子生物学与基因工程的迅猛发展，利用基因工程方法将抗真菌病基因，如几丁质酶基因（chitinase gene，chi）、β-1，3葡聚糖酶基因（β-1，3-glucan，β-Glu）和核糖体失活蛋白基因（ribosome inactivating protein gene，rip）导入有重要价值的植物，来培育抗病品种，已经成为一条有效的植物抗病分子育种新途径，并展现出美好的应用前景。对转基因植物进行环境安全评价是转基因植物产业化的重要过程，转基因植物的安全性评价要经过合理的试验设计和严密科学的试验程序，以获得足够的真实的数据。根据这些数据可以判断转基因植物的田间释放或大规模商品化生产是否安全，对试验证明安全的转基因植物可以正式应用于农业生产。本研究以本研究室获得的转chi+rip双价抗真菌病基因大豆株系G0431、G0433的T3代植株为试材，在温室条件下对其进行了大豆疫霉根腐病和大豆灰斑病的抗病性检测，并对其主要的农艺性状进行了调查与分析，T3代植株收获后形成T4代植株种子。经农业部审批（农基安办字2006-T002），对上述2个株系的T4代植株在黑龙江省进行了中间试验的环境安全评价，系统研究了转基因大豆的遗传稳定性、农艺性状、环境适应能力及生存竞争能力、外源基因表达及其功能性状的有效性等，完成了转基因大豆中间试验的全部研究内容，为转基因大豆的中间试验的环境安全作出了科学评价，也为转基因大豆的环境释放和生产性试验的环境安全性评价提供了重要理论依据。本研究的主要研究结果如下：1．转chi+rip双价基因大豆T3代植株的抗病性检测与农艺性状调查（1）株系G0431和G0433的T3代植株的分子生物学检测对株系G0431和G0433的T3代植株进行了PCR及real-time PCR检测，PCR检测结果表明，株系G0431和G0433的T3代植株均能同时扩增出2个外源目的基因；Real-time PCR检测表明，2个外源目的基因在转基因大豆基因组DNA中的起始浓度均为其在未转化植株中的约215倍，证明转基因大豆T3代植株中同时含有2个外源目的基因。（2）株系G0431和G0433的T3代植株中外源基因表达的检测以G0431和G0433的T3代植株的cDNA为模板为模板，以未转化株cDNA为阴性对照，无菌水代替模板cDNA为负对照进行real-time PCR检测。结果表明，2个外源目的基因在G0431和G0433的T3代植株cDNA中的起始浓度分别为其在未转化植株中的约211和215倍，证明2个外源基因在转基因大豆植株中均同时进行表达。（3）株系G0431和G0433的T3代植株的抗病性检测对转基因大豆株系G0431和G0433的T3代植株进行了大豆疫霉根腐病和大豆灰斑病的抗性检测，结果表明，2个株系对大豆疫霉根腐病的抗病性均由原来的高感提高到高抗，对大豆灰斑病的抗病性由原来的中抗提高到高抗水平。（4）株系G0431和G0433的T3代植株主要农艺性状的调查与分析对转基因大豆主要的产量性状、形态性状以及品质性状进行了调查与分析，结果表明，在产量性状上，株系G0431和G0433与对照相比均无明显差异；在形态性状上，株系G0431结荚习性由亚有限结荚习性变成了无限结荚习性，株系G0433株高低于对照、生育期短于对照、结荚习性由亚有限结荚习性交成了无限结荚习性：在品质性状上，与对照相比，2个转基因大豆株系蛋白含量有所下降而油分含量有所上升，达到显著水平。2．转chi+rip，双价基因大豆T4代植株中间试验的环境安全评价（1）转基因大豆的遗传稳定性对转基因大豆株系G0431和G0433的T4代植株进行了real-time PCR检测，结果表明，2个外源基因在转基因大豆中的起始浓度分别为其在未转化植株中起始浓度的约215倍，充分证明转基因大豆T4代植株中同时含有2个外源基因，外源基因已稳定遗传至T4代。（2）转基因大豆的农艺性状对转基因大豆T4代植株主要的产量性状、形态性状以及品质性状进行了调查与分析，在产量性状上，2个转基因大豆株系与对照相比均无明显差异：在形态性状上，株系G0431结荚习性由亚有限结荚习性变成了无限结荚习性，株系G0433株高低于对照、生育期短于对照、结荚习性由亚有限结荚习性变成了无限结荚习性；在品质性状上，与对照相比，2个转基因大豆株系蛋白含量有所下降而油分含量有所上升，达到显著水平。（3）转基因大豆的生存竞争能力与环境适应能力①竞争性无论是在大豆适宜生长季节还是非适宜生长季节，在各种播种条件下，2个转基因大豆株系与对照在田间杂草种类、数目及覆盖度方面均无明显差别；2个株系转基因大豆的覆盖度均低于对照，达到5％显著水平；2个株系转基因大豆的出苗率与成苗率低于对照，达到5％显著水平：在株高方面，株系G0431与对照相比无差别，株系G0433显著低于对照，达到5％显著水平。②自生苗产生率转基因大豆与对照的自生苗产生率均为0，无明显差别。③繁育系数株系G0431与对照相比，在始花期、盛花期、成熟期及单株粒数与对照相比无明显差异，在单株粒数方面与对照相比无明显差异；株系G0433与对照相比，在始花期、盛花期、成熟期均明显早于对照，达到1％显著水平；在单株粒数方面与对照相比无明显差异。④种子落粒性在大豆适合生长季节播种，转基因大豆与对照在种子落粒性方面无明显差别，在大豆非生长季节播种由于大豆不能正常成熟不能进行种子落粒性实验。⑤种子的自然延续能力无论是地表处理还是地下20cm处理，转基因大豆与对照相比，在正常幼苗、不正常幼苗、未发芽种子和新鲜不发芽种子方面均无明显差异，转基因大豆与对照的种子延续能力相同。（4）转基因大豆中外源基因表达及其功能性状的有效性对株系G0431和G0433的T4代植株中2个基因进行了real-time PCR检测，结果表明2个外源基因均进行了转录表达；对株系G0431和G0433的T4代植株进行大豆疫霉根腐病和大豆灰斑病的抗病性检测，与对照相比，2个转基因大豆株系对大豆疫霉根腐病的抗性有明显提高，对大豆灰斑病的抗性与对照相同，均为中抗，无明显差别。
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相关论文文献
- [1].转chi+rip双价抗真菌病基因大豆遗传稳定性分析[J]. 东北农业大学学报 2011(07)