灵芝漆酶的发酵优化及其应用的初步研究

论文摘要

漆酶（EC 1.10.3.2,苯二酚：氧化还原酶）是一类具有生物漂白、降解环境污染物、废水处理等应用潜力的含铜多酚氧化酶,普遍存在高等植物、昆虫、真菌及细菌中。漆酶既可用于降解偶氮染料（如甲基橙）和纺织品的脱色；催化氧化芳胺类如苯胺、酚类物质等芳香族污染物等,也可催化合成的特定化合物,因而成为生物学、化学和环境科学等领域十分活跃的一个研究热点。本研究以灵芝K-17漆酶为对象,进行了发酵培养及其应用等方面的研究。灵芝菌在含有无毒害的农副产品的培养基上能分泌木质素降解酶之一的漆酶而受到越来越多的关注。将三因素三水平的Box-Behnken因子设计和响应面分析法相结合,对漆酶发酵培养基进行了优化。结果表明,在其他营养成分定量的条件下,农副产品玉米粉、麸皮和花生壳是影响漆酶产量的主要因素。响应面分析法优化得到的培养基组成为（g/L）：玉米粉17.6,麸皮24.7,花生壳22.4,KH2PO4 1.5,葡萄糖20。在此条件下所得漆酶最大酶活为5242.61U/L,证明农副产品显著影响漆酶发酵产量。并对发酵得到的漆酶进行了同工酶电泳分析,结果表明该漆酶没有同工酶,是单一组分。应用灵芝K-17漆酶催化茶多酚合成茶黄素,在乙酸乙酯体系中,底物茶多酚浓度为30mg/ml,加酶量与体系体积比为1/25,以空气作为反应所需氧的来源,于40℃水浴振荡反应30min,超声波终止反应。真空旋转蒸发仪回收乙酸乙酯,用4-甲基-2-戊酮萃取产物,经高效液相色谱（HPLC）和LC-MS检测,得到产物茶黄素-3-单没食子酸酯及少量的同分异构体茶黄素-3’-单没食子酸酯,产物浓度为1.37 mg/ml。将单因素分析及响应面试验设计应用于漆酶、果胶酶和纤维素酶浸提绿茶中茶氨酸的研究,在单因素试验的基础上,采用响应面分析法建立酶法提取茶氨酸的二次多项数学模型,并验证了该模型的有效性；探讨了果胶酶、纤维素酶、漆酶3个因子的交互作用及其最佳水平；确定了这3种酶提取茶氨酸的最佳复合配比。单因素试验表明,果胶酶、漆酶、纤维素酶的最适处理温度为50℃,最佳提取时间为2h。响应面分析结果表明：果胶酶、纤维素酶、漆酶显著影响茶氨酸的提取效果,在果胶酶、纤维素酶和漆酶的添加量分别为0.6ml、0.6ml、0.48ml的优化条件下,茶氨酸的提取率达11.60%。采用生物酶法直接从绿茶中提取茶氨酸,操作工艺简单,设备要求低,且是环境友好型的浸提方法,因而具有很好的开发应用潜力。通过响应面分析法和Box-Benhnken设计,建立了酶法提取香菇多糖的二次回归模型,优化的香菇多糖提取条件为：固定料液比（1：15）和反应温度（40℃）,果胶酶浓度为7.11%,纤维素酶浓度为6.82%,漆酶浓度为3.69%,香菇多糖的提取率达37.07%。提取率比使用单一酶实验组大幅度提高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1 漆酶的研究现状
• 1.1 漆酶的化学结构及来源
• 1.2 漆酶的分子生物学
• 1.3 应用领域
• 1.4 灵芝漆酶的研究现状
• 2 漆酶的应用
• 2.1 用于环境污染的控制
• 2.2 用于木质纤维素的修饰
• 2.3 纺织工业
• 2.4 生物传感器
• 2.5 食品工业
• 2.6 制药工业
• 2.7 生物催化合成
• 3 本研究的目的和意义
• 第二章 漆酶发酵优化
• 1 引言
• 2 响应面法优化产漆酶发酵培养基
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 菌种
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 培养条件
• 2.1.5 批量发酵
• 2.1.6 最佳养分来源的确定
• 2.1.7 响应面分析（RSA）实验设计及统计分析
• 2.1.8 同工酶电泳分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 影响漆酶产量显著因子
• 2.2.2 Box-Behnken实验设计及结果
• 2.2.3 漆酶产量的响应面分析
• 2.2.4 模型的验证
• 2.2.5 漆酶同工酶分析
• 2.3 讨论
• 第三章 漆酶催化茶多酚转化生成茶黄素的研究
• 1 引言
• 2 酶促合成反应
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 化学试剂
• 2.1.2 样品准备
• 2.1.3 生物合成茶黄素反应条件
• 2.1.4 HPLC的检测条件
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 酶促反应条件的优化
• 2.2.2 HPLC与LC-MS检测
• 2.3 讨论
• 第四章 漆酶辅助提取茶氨酸
• 1 国内外茶氨酸生产工艺的研究现状
• 2 响应面法优化果胶酶、漆酶、纤维素酶提取茶氨酸的最佳复合酶配比
• 2.1 实验材料与设备
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 茶氨酸提取工艺流程
• 2.2.2 茶氨酸的提取率
• 2.2.3 HPLC检测茶氨酸
• 2.2.4 单因素试验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 茶氨酸标准曲线的绘制及样品分析
• 2.3.2 单因素浸提效果分析
• 2.3.3 响应面法优化茶氨酸提取工艺
• 2.4 讨论
• 第五章 漆酶辅助提取香菇多糖
• 1 香菇多糖提取工艺的研究现状
• 2 响应面法优化生物酶法提取香菇多糖的提取工艺
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 香菇多糖的提取和测定及单因素试验
• 2.2.2 香菇多糖提取的响应面法实验设计
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 香菇多糖提取的单因素试验
• 2.3.2 香菇多糖提取的响应面分析与结果
• 2.4 结论
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文目录