论文摘要
一、目的放创复合伤是战时核爆炸和平时核事故中所发生的主要伤型之一,损伤后其伤口愈合主要表现为愈合延迟,甚至长期不愈合。CCN1（Cysteine rich 61,Cyr61/CCN1）是即刻早期基因CCN家族成员,体外研究显示其能促进细胞黏附、增殖、迁移,调节血管生成,影响基质代谢,参与创伤修复,关于CCN1在放创复合伤愈合中的作用尚未见报道。本课题检测CCN1蛋白和mRNA在大鼠放创复合伤创面肉芽组织的表达情况;构建重组腺病毒AdCCN1感染创面组织后促进创伤愈合以及对创伤修复相关因子的表达调控。通过研究,探讨CCN1在放创复合伤愈合中的作用及机制。为深入认识伤口愈合过程的机制提供新的视角,并为探索促愈治疗新药提供新的途径。二、方法和结果1.放创复合伤大鼠模型的建立及CCN1在创面组织中的表达和意义:将大鼠随机分为单纯创伤组和放创复合伤组。放创复合伤组采用60Coγ射线进行全身照射在照射后1h内,制背部皮肤全层切除伤口。在伤后的第0、3、6、9、15、21d取材,用RT-PCR和免疫组织化学染色分别检测CCN1 mRNA和蛋白的表达水平,发现在伤后约15d之前CCN1蛋白和mRNA较单纯创伤表达下降,约21d时表达量升高。CCN1的表达较单纯创伤组延迟。2. CCN1腺病毒的构建、制备及其活性检测:通过酶切连接的方式将pCMV-CCN1中的小鼠CCN1表达框连入pAdTrace-TO4穿梭载体中获得pAdTrace-CCN1,线性化后在AdEasy-1大肠杆菌中进行同源重组,获得pAdCCN1重组腺病毒质粒,随后线性化转染293细胞进行病毒颗粒包装。收集病毒裂解液并反复感染293细胞扩增病毒后感染创面CHO细胞和创面组织细胞,用Western Blot和IHC鉴定CCN1在CHO细胞中正确分泌,并且在创面组织细胞中高表达。3.CCN1重组腺病毒在放创复合伤修复中的作用及其机理的实验研究:致伤后,立即在创面边缘分别皮下注射等量AdCCN1病毒和AdRFP病毒,7天后取材固定制作石蜡切片,HE染色表明AdCCN1组创面,成纤维细胞增多,微血管密度增高, IHC检测MMP1、TIMP1、bFGF等创伤愈合相关因子表达均升高。三、结论1.建立了放创复合伤大鼠模型,检测到创面肉芽组织中在伤后约15d之前CCN1蛋白和mRNA较单纯创伤表达下降,约21d时表达量升高。CCN1的表达下降可能是放创复合伤难愈的原因之一。2.应用AdEasy系统构建、制备AdCCN1重组腺病毒,酶切鉴定结果与预期相符;发现其可以感染CHO细胞正确分泌CCN1;可以有效感染创面组织细胞,并可使其高表达CCN1。3.AdCCN1在放创复合伤愈合中的作用机理可能在于:AdCCN1感染创面组织细胞高表达分泌CCN1后,通过提高MMP1、TIMP1、bFGF等创伤愈合相关因子的表达发挥作用。
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