斑马鱼Tol2转座子介导的基因捕获及foxj1基因功能研究

论文摘要

斑马鱼胚胎的早期发育过程是一个复杂的生物学过程,有多条信号通路及通路中的众多关键基因参与并调控着胚胎发育的全过程。通过大规模化学诱变（ENU诱变）和反转录病毒插入诱变,已经筛选到很多斑马鱼胚胎发育的突变体,揭示了一批相关基因的功能。本论文的研究是利用Tol2转座子介导的基因捕获的方法产生GFP表达特异的转基因鱼家系,并筛选斑马鱼胚胎早期发育的突变体,继而分析相关突变基因在胚胎发育过程中可能的功能。本研究中共筛选到45个转基因鱼家系,其中一些转基因鱼家系胚胎的GFP的表达在发育过程中呈现出一定的时空特异性。但其胚胎并没有明显的突变表型。TZBGS010转基因鱼家系的荧光分布具有一定的特异性,胚胎受精后24小时时GFP荧光主要集中在嗅窝,耳泡,神经底板和肾管中。TAIL-PCR分析表明,在该转基因鱼家系中转座子所捕获的基因为foxj1b基因。Foxj1是一个转录因子,已有研究报道表明,其在脊椎动物中Foxj1与系统性自身免疫和纤毛的生成有关。斑马鱼的基因组表达两个foxj1同源基因,foxj1a和foxj1b。在我们的研究工作中,通过在单细胞时期注射morpholino抑制foxj1a或foxj1b表达会导致早期的左右不对称的标志性基因lefty2, southpaw, pitx2c和后期的内部器官的标志性基因tpm4-tv1, cmlc2, cp等表达出现随机分布。通过注射体外合成的mRNA过量表达foxj1a或foxj1b同样会扰乱胚胎正常的左右不对称发育。这些结果表明,在斑马鱼的胚胎发育中两个foxj1基因对于正常的左右不对称发育是必须的。不同于foxj1b,在背部前驱细胞中特异将foxj1a敲除,也会使得左右不对称的标志性基因表达出现随机分布的情况。因此,foxj1a通过背部前驱细胞以细胞自主性调控的方式调节左右不对称发育而foxj1b基因的作用则是非自主性的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 斑马鱼中突变体筛选的方法
• 1.1.1 ENU 诱变
• 1.1.2 利用单倍体进行突变筛选
• 1.1.3 利用反转录病毒进行的插入突变筛选
• 1.1.4 斑马鱼中母源基因突变体的筛选
• 1.2 Tol2 转座子研究
• 1.2.1 Tol2 转座子的发现
• 1.2.2 斑马鱼中利用Tol2 转座子的研究进展
• 1.3 斑马鱼胚胎的左右不对称发育
• 1.3.1 脊椎动物中左右不对称轴线的形成
• 1.3.2 参与左右不对称发育的信号分子
• 1.3.3 斑马鱼中左右不对称发育的形成
• 1.4 FOXJ1 基因的研究
• 1.4.1 foxj1 基因家族的研究进展
• 1.4.2 斑马鱼中foxj1 基因的研究进展
• 1.5 本课题的目的和意义
• 第2章材料与方法
• 2.1 实验用斑马鱼的饲养和品系
• 2.2 Tol2 转座子介导的诱变及突变体筛选
• 2.2.1 转座载体的构建
• 2.2.2 整体突变筛选研究策略
• 2.3 Tol2 转座子旁侧序列的克隆和插入基因的确定
• 2.3.1 斑马鱼胚胎基因组DNA 的提取
• 2.3.2 Inverse PCR
• 2.3.3 TAIL-PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR）
• 2.3.4 LM-PCR（linker mediated PCR）
• 2.3.5 PCR 检测胚胎的基因型
• 2.4 RT-PCR 验证Tol2 插入基因与报告基因融合
• 2.4.1 斑马鱼胚胎总RNA 的提取
• 2.4.2 RT-PCR
• 2.5 斑马鱼FOXJ1A 与FOXJ1B 基因的克隆及相关载体的构建
• 2.5.1 foxj1a 与foxj1b 基因mRNA 表达载体的构建
• 2.5.2 foxj1a 与foxj1b 基因原位杂交探针载体的构建
• 2.5.3 检测foxj1a 基因Morpholino 效果的报告载体的构建
• 2.6 MRNA 的体外合成与原位杂交探针的制备
• 2.6.1 体外合成m RNA
• 2.6.2 标记原位杂交探针
• 2.7 MORPHOLINO 的设计与合成
• 2.8 显微注射操作
• 2.8.1 单细胞时期的显微注射
• 2.8.2 中囊胚时期的显微注射
• 2.9 斑马鱼整胚原位杂交
• 2.10 图像拍摄与数据统计
• 第3章 斑马鱼中Tol2 转座子介导的基因捕获及特异表达基因的筛选
• 3.1 筛选转基因鱼及其家系的建立
• 3.2 筛选到的转基因鱼家系GFP 的表达情况
• 3.3 GFP 特异表达转基因鱼家系中的转座子插入点分析
• 3.3.1 TZBGS041 的插入点分析
• 3.3.2 TZBGS010 的插入基因分析
• 3.4 突变体筛选和相关表型分析
• 3.5 本章总结
• 第4章 斑马鱼FOXJ1 基因的功能研究
• 4.1 FOXJ1A 和FOXJ1B 在斑马鱼中的表达谱
• 4.2 抑制斑马鱼中FOXJ1A 或FOXJ1B 的表达，影响早期的左右不对称发育
• 4.3 抑制斑马鱼中FOXJ1A 或FOXJ1B 的表达，影响心脏和左右不对称的内脏器官的不对称分布
• 4.4 FOXJ1A 和FOXJ18 分别以细胞自主调节和非自主调节的方式调控左右不对称发育
• 4.5 FOXJ1A 和 FOXJ18 在调控胚胎早期左右不对称发育过程中有冗余的功能
• 4.6 过量表达FOXJ1A 或者 FOXJ18 也会影响胚胎正常的左右不对称发育
• 4.7 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果