獭兔白细胞介素-2（IL-2）基因克隆及真核表达

论文摘要

白细胞介素（IL-2）主要由Th1细胞产生,在免疫调节中具有重要作用。白细胞介素2的生物学作用以刺激T细胞增生为主,除此之外,可诱导产生细胞毒性T淋巴细胞（TC）,也可促进TH细胞增殖,调节NK细胞等。它具有活化机体免疫应答、全面提高机体细胞免疫和体液免疫的功能。獭兔具有很高的经济价值,但在养殖过程中对疾病抵抗力较弱,常受到寄生虫、细菌和病毒的危害。目前,对其疾病的防治仍以药物控制为主,频繁用药导致耐药性菌（虫）株出现,加上药物自身存在的毒副作用都给獭兔的疾病防治及繁殖工作带来了很大的难度。因而为进一步搞好獭兔的饲养管理及疾病控制,就需要研究新的防治技术,通过细胞因子的作用来提高獭兔的自身免疫力将可能是一个相对有效的拯救措施之一。1.本试验应用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术,从ConA诱导培养的獭兔外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到獭兔IL-2基因,并将其克隆到pMD18-T载体中。经菌落PCR鉴定、序列测定及序列分析,克隆得到的IL-2基因开放阅读框由462个核苷酸组成,编码一个由153个氨基酸组成的多肽,包括编码20个氨基酸的信号肽和133个氨基酸的成熟肽。与长毛兔、欧洲兔及肉兔IL-2基因同源性分别为100%、99.4%及98.9%,与Genbank中其他哺乳动物的IL-2序列比较,它与猿、人、猫、马、家犬、猪、大熊猫、水牛、山羊及鼠等的核苷酸同源性在75.0%（鼠）～86.9%（猿）之间;进化树构建结果表明兔与猿IL-2基因遗传距离较近。2.将克隆在pMD18-T载体中的IL-2基因全编码序列经BamHI和XhoI酶进行双酶切,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳,采用胶回收试剂盒回收纯化酶切产物,然后与同样酶切的pcDNA3.1（+）质粒定向连接并转化到大肠杆菌中,构建真核表达质粒pcDNA3.1（+）-IL-2,并用酶切分析和序列测定进行了鉴定,结果酶切分析和序列测定都证实真核表达质粒成功构建。3.通过脂质体介导将构建的真核表达重组质粒转染到Cos-7细胞,获得具有一定生物学活性的IL-2蛋白。本研究成功克隆了獭兔IL-2基因,构建了真核表达质粒,并进行了真核蛋白的表达,获得具有一定生物活性的蛋白。本研究为了解各物种间白细胞介素2序列的进化关系提供理论依据,同时也为进一步研究IL-2重组蛋白的免疫学特性和生物学活性及其应用奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 IL-2分子生物学研究进展
• 1.2 IL-2的应用
• 1.3 实验目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验动物
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 菌株、质粒和细胞
• 2.1.4 常用缓冲液和培养基的配制
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.1.6 主要生物信息数据库和计算机软件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 獭兔IL-2基因的克隆
• 2.2.2 IL-2基因重组真核表达载体的构建
• 2.2.3 脂质体介导的转染及IL-2活性检测
• 3 试验结果
• 3.1 獭兔IL-2基因的克隆与序列分析
• 3.1.1 总RNA提取
• 3.1.2 RT-PCR
• 3.1.3 基因克隆
• 3.1.4 重组pMD18-T-IL-2质粒的测序鉴定
• 3.1.5 序列分析
• 3.2 獭兔IL-2基因真核表达载体构建及表达
• 3.2.1 IL-2表达基因的亚克隆
• 3.2.2 重组质粒pMD18-T-IL-2菌落PCR鉴定
• 3.2.3 重组pMD18-T-IL-2质粒的酶切
• 3.2.4 重组pcDNA3.1（+）-IL-2质粒的酶切鉴定
• 3.2.5 重组pcDNA3.1（+）-IL-2质粒的测序鉴定
• 3.3 重组表达质粒转染Cos-7细胞后,表达产物的鉴定
• 3.3.1 RT-PCR结果
• 3.3.2 獭兔IL-2生物学活性检测
• 4.讨论
• 5.结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文