论文摘要
基因治疗是现代医学研究的热点问题,以肝为靶点的基因治疗更是倍受关注。近年来,肝靶向性基因治疗取得了很大的进展。肝细胞是基因定向转导的理想靶部位,因为肝脏是少数几个实质细胞和血液直接相通的器官之一。目前对原发性肝癌（primary liver carcinoma）多主张采用手术联合放化疗的综合治疗为主,其五年生存率一般在5%左右,其疗效仍然不能令人满意。因此,探讨新的治疗方法具有极其重要的意义。近年来肿瘤的基因治疗发展迅速,主要的方法有自杀基因、免疫基因、多药耐药基因以及抗血管生成基因等。其中自杀基因被认为是最有前景的基因治疗方法之一。自杀基因治疗（Suicide gene therapy）又称酶/药物体前体疗法（enzyme-prodrug therapy,EPT）,是利用转基因技术将哺乳动物中所不含有的自杀基因转入到哺乳动物肿瘤细胞中,该基因表达的产物可将无毒性的药物前体转化为毒性药物,从而选择性的杀伤肿瘤细胞,常用的自杀基因有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核甘酸激酶（herpes simplex virus-thymidine kinase,HSV-TK）基因和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（E.coli-cytosine deaminase,CD）基因。已有的研究证实联合基因治疗具有单一自杀基因无可比拟的优越性,越来越受人们关注。目的:本研究旨在构建真核表达质粒pEGFP-N1-lis,并电穿孔转染HepG2细胞,以寻求有效的自杀基因治疗方法。方法:通过增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与linamarase融合蛋白真核表达载体构建和表达,为linamarase用于肝癌基因治疗提供科学的实验依据。方法:首先根据linamarase的DNA序列分别设计、合成引物,应用Rt-PCR法扩增linamarase基因,序列测定分析,并将扩增后产物插入克隆载体pEGFP-N1中,获得重组质粒pEGFP-N1-lis并进行菌落鉴定及重组质粒的酶切分析。然后以电穿孔方法将重组表达质粒pEGFP-N1-lis转染HepG2细胞,新霉素（Geneticin G418）筛选后获得稳定表达的HepG2-lis细胞,并经RT-PCR鉴定lis是否整合到HepG2细胞DNA链中并转录表达,应用Westemblot检测相关蛋白的表达。结果:成功克隆了木薯linamarase基因,并进行了DNA序列分析和基因库报道的基因序列基本一致,然后将克隆的linamarase基因插入克隆载体pEGFP-N1,成功构建了重组表达质粒pEGFP-N1-lis,并分别进行了菌落分析和酶切鉴定。将重组质粒pEGFP-N1-lis成功转入HepG2细胞,经G418筛选后获得稳定表达lis基因的HepG2-lis细胞,将经重组质粒DNA转染HepG2细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光,RT-PCR显示长度为1600左右的阳性条带,证实目的基因已整合到HepG2细胞染色体DNA链中并转录表达,目的基因转染对HepG2细胞的形态及生长特性影响不大。结论:pEGFP-N1-lis真核载体的构建为进一步进行linamarase的作用机理及抑癌效应研究奠定了基础;可望为肝癌基因治疗提供有效途径。