油菜核盘菌菌丝体转化体系的建立及ISO与OXA基因RNA干扰载体的构建

论文摘要

油菜核盘菌是一种真菌病害,我国的甘型油菜因为长期受到菌核病的危害,其产量和品质都受到严重影响。核盘菌在室内条件下不易产生孢子,很难通过转化孢子的方式来研究菌核病致病的机理。为了建立一个简便的核盘菌遗传转化方法,深入研究核盘菌的致病机理,本研究以B7质粒为外源基因,以油菜核盘菌菌丝体为外植体,采用农杆菌介导的遗传转化方法,对油菜核盘菌进行转化,成功获得了转荧光蛋白标记基因的菌丝和菌核,转基因菌丝和菌核均能正常生长,至此建立了油菜核盘菌菌丝体遗传转化体系。为了进一步明确草酸与受侵染植物发病的关系,本实验克隆了与草酸形成直接相关的草酰乙酸水解酶和异柠檬酸裂解酶两个基因5’端保守序列中的一个片段,长度分别为303bp和167bp,并分别构建了RNA干扰载体,用于沉默这两个基因的表达。通过酶切分析和PCR检测,证实干扰载体构建成功。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 丝状真菌遗传转化系统研究进展
• 1.1 转化的丝状真菌种类与选择标记
• 1.2 丝状真菌转化方法
• 2 RNAi的研究
• 2.1 RNAi的发现:
• 2.2 RNA干扰机制
• 2.3 RNAi的应用:
• 3 本研究的目的和意义
• 第二章 油菜核盘菌菌丝遗传转化及转化子的筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 头孢霉素和潮霉素B浓度梯度筛选
• 2.2 菌丝转化过程
• 2.3 抗性菌丝PCR筛选结果
• 2.4 荧光蛋白观察
• 第三章 ISO与OXA基因干扰片段的克隆与RNAi载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 目的序列克隆与PCR扩增检测结果:
• 2.2 测序结果的同源性比对
• 2.3 ISO基因片段干扰体的酶切验证结果
• 2.4 OXA基因片段干扰体的酶切验证结果
• 2.5 转化农杆菌质粒PCR检测结果
• 第四章 讨论
• 1 关于油菜核盘菌菌丝体的转化再生体系
• 1.1 外植体
• 1.2 关于菌丝体DNA的提取
• 1.3 关于转化菌丝单体的获得
• 2 关于干扰片段的克隆
• 2.1 干扰片段的选择
• 2.2 引物酶切位点的设计
• 3、结论
• 参考文献
• 缩写表
• 致谢