马铃薯病毒和类病毒的分子诊断方法研究

论文摘要

自然侵染马铃薯作物的病毒超过25种。其中，部分病毒普遍发生且对马铃薯作物造成严重的危害，显著降低了马铃薯的产量和品质。据文献报道，在中国马铃薯产区，对马铃薯作物产生重要危害的病毒有马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）和马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）。本论文基于检测病毒的数目和检测样品的多少，建立四套适合不同检测需求的马铃薯病毒检测方法。一是：病毒粒子直接吸附-反转录-聚合酶链式反应（VDA-RT-PCR），适合少量样品的单种病毒检测；二是：多重RT-PCR，以18S核糖体RNA（rRNA）作为内参照，针对以上描述的5种重要病毒的同时检测；三是：寡聚核苷酸微点阵技术，针对7种马铃薯病毒和一种类病毒的同时检测；四是：玻片杂交方法，适合大量马铃薯样品的同时检测。本论文首先利用分子克隆方法对PVA、PVX、PVY、PVS、PLRV、烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）和PSTVd保守序列以及18S rRNA进行扩增、克隆和测序；并对测序结果进行同源性分析。同源性分析结果表明PVX与组Ⅱ株系的同源性高达94.0％-100.0％，而与组Ⅰ株系的同源性则只有83.0％-86.0％；可见，该分离物应属于组Ⅱ株系。CMV与亚组Ⅰ株系的同源性高达94.5％-98.6％，而与亚组Ⅱ株系的同源性则在75.7％-78.9％；可见，该分离物应属于亚组Ⅰ株系。然而，PVY病毒则未表现序列同源性与株系之间的联系，序列同源性呈连续分布（88.0％-100.0％），其它的病毒或PSTVd的同源性除个别序列外，均在94.0％以上。高同源性说明了以上几种病毒和类病毒的序列可以用于制备病毒、病毒株系和类病毒特异的探针。病毒粒子直接吸附—反转录—聚合酶链式反应（VDA-RT-PCR）该方法针对于少量样品的单个病毒检测。我们利用离心管壁对病毒粒子的非特异吸附特性，以PVX作为研究材料，建立一种简单、快速、无需酚氯仿抽提制备马铃薯病毒RNA的方法，该方法被称为病毒粒子直接吸附法（Virion-direct absorbent，VDA）。结合RT-PCR反应对VDA制备的病毒RNA进行检测。一系列条件试验结果表明：利用普通提取缓冲液、1hr孵育时间和70℃变性吸附于管壁的病毒粒子可以获得最优化的病毒RNA制备方法。吸附于管壁的病毒粒子在室温的储存期限高达11天。优化的VDA-RT-PCR方法同样适合于PVY和PVS检测。灵敏度测试结果表明我们建立的VDA-RT-PCR法检测PVX的最低极限为1.25 ng，相当于ELISA检测的水平。尽管该方法的检测灵敏度不高，但是，该方法非常简单、快速和经济，单管即可完成病毒RNA的提取。多重RT-PCR该方法利用18S rRNA作为内参照，针对5种重要马铃薯病毒的同时检测。一些报道利用了植物的NADH脱氢酶mRNA作为内参照来监控核酸提取和RT-PCR反应的成功与否。然而，在real-time RT-PCR体系中，18S rRNA也常被用作内参照。为此，为了获得更合适的内参照，我们比较了寄主的nad2 mRNA和18S rRNA二者的检测最低极限和降解动力学。检测后者的最低极限是前者的105倍，这说明18S rRNA作为内参照具有更高的灵敏度；而且，与PVX相比，18S rRNA比nad2 mRNA表现更加相似的降解动力学属性。为此，我们选择了18S rRNA作为一套同时检测5种重要马铃薯病毒的多重RT-PCR反应体系的内参照。通过一系列的优化试验，结果表明在标准RT-PCR反应体系的基础上，改变Taq HS DNA聚合酶的浓度为0.1 U／μl和MgCl2浓度为4.0 mM，可以获得最优化的、能同时扩增PLRV、PVY、PVX、PVA、PVS和18S rRNA目的片段的多重PCR反应体系。优化的多重RT-PCR反应体系能扩增不同的病毒组合。该体系检测PVX的灵敏度是DAS-ELISA方法的100倍，前者在后者未检测到病毒的几个样品中检测到PVX和PVS，这也说明了优化的多重RT-PCR反应体系比DAS-ELISA具有更高的检测灵敏度。寡聚核苷酸微点阵技术该方法针对7种马铃薯病毒和一种类病毒的同时检测。目前，已有文献报道DNA微点阵技术应用于马铃薯病毒的检测。这些微点阵技术利用反转录标记方法使得它们的检测灵敏度均偏低，这是这些DNA微点阵技术的缺陷所在。因此，我们试图利用多重PCR标记方法和25 mer左右的寡聚核苷酸探针，建立高灵敏、高特异、同时检测7种马铃薯病毒和PSTVd的微点阵技术。研究结果表明：我们构建的寡聚核苷酸微点阵体系特异性很强，标记产物与异源探针不发生任何的交叉杂交；通过对两组多重标记PCR的优化，能同时标记PLRV、PVY、PVX、PVA、PVS、CMV、TMV、PSTVd和18S rRNA。我们构建的寡聚核苷酸微点阵结合优化的多重标记PCR方法可以检测10-9倍数稀释的CMV，而核酸斑点杂交技术检测的最低极限为10-5或10-6，可见，多重标记PCR方法的介入显著提高了寡聚核苷酸微点阵技术的检测灵敏度。我们建立的寡聚核苷酸微点阵技术的高灵敏度显著高于其它马铃薯病毒检测微点阵技术。玻片杂交该方法适合于同时检测大量马铃薯样品，具备高通量检测的特点。DNA微点阵技术作为诊断工具，它的优点在于能同时对多个病原物进行检测，但是，该技术并不适合于从大量样品中检测个别病毒。为了解决这个问题，我们试图将从马铃薯组织中提取的总RNA样品直接点在氨基硅烷玻片表面，用CY5标记的探针进行杂交，建立一套同时检测大量马铃薯样品的玻片杂交方法，来替代常规的RNA核酸斑点杂交（NASH）。条件试验结果表明适合于尼龙膜杂交的甲酰胺点样液和DMSO点样液并不适合于氨基修饰的玻片，其对RNA在氨基玻片表面的结合效率显著低于SSC缓冲液。高浓度SSC（5×）有利于RNA在玻片表面的结合，而相对低浓度SSC（1×）则表现显著的线性相关性。不同类型的玻片对RNA结合效率有着显著的差别，氨基硅烷玻片具有明显的优势，其产生的杂交信号显著高于多聚赖氨酸和醛基修饰的玻片。为此，我们选择了1×SSC作为点样缓冲液和氨基硅烷玻片作为RNA支持物，测定了玻片杂交的检测灵敏度。结果显示：PCR方法标记和随机引物方法标记的探针检测TMV RNA的极限分别为1.71 pg和13.67 Pg；而用32p标记的探针和尼龙膜杂交检测TMV RNA的最低量为6.83 pg。尽管PSTVd特异探针与PVY侵染的心叶烟总RNA出现弱的交叉杂交，但是在PVA、PVY和ZYMV三者之间没有出现交叉反应，这说明该方法还是具有相当高的特异性。田间马铃薯样品的检测结果说明了该方法具有同时检测大量马铃薯样品的能力。每种诊断方法都有它的优点和不足之处，包括本论文建立的4套马铃薯病毒检测方法，比如说，用多重RT-PCR反应检测单种病毒，这样就显著增加了检测的成本，而用VDA-RT-PCR方法既可以节省成本（特别是RNA提取的试剂），又可以节省时间和劳动力。如果从大量马铃薯样品中检测少数几种病毒，我们应该选择玻片杂交方法，而不是寡聚核苷酸微点阵技术。如果从少数样品中检测多个病毒，我们应该选择多重RT-PCR或寡聚核苷酸微点阵技术，而不是玻片杂交。因此，我们可以根据不同的检测需求，有针对性地选择最为合适的诊断方法，使

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述:马铃薯病毒诊断方法的研究进展
• 1.1 马铃薯作物的特性及其经济价值
• 1.1.1 马铃薯特性
• 1.1.2 马铃薯经济价值
• 1.1.3 重要病虫害
• 1.1.4 马铃薯病毒病及其重要性
• 1.1.5 马铃薯无毒种薯生产的重要性
• 1.1.6 马铃薯病毒诊断方法
• 1.1.6.1 症状学观察
• 1.1.6.2 指示植物测定
• 1.1.6.3 电子显微镜技术
• 1.1.6.4 双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）分析
• 1.1.6.5 血清学方法检测
• 1.1.6.6 核酸斑点杂交（Nucleic acid spot hybridization,NASH）
• 1.1.6.7 聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）
• 1.1.6.8 DNA微点阵（DNA microarray）
• 1.2 研究目的和意义
• 1.3 研究内容
• 1.4 研究的创新点
• 第二章 侵染马铃薯的主要病毒和类病毒基因克隆与序列分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 毒源保存
• 2.1.2 总RNA的提取
• 2.1.3 引物设计和合成
• 2.1.4 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 2.1.5 PCR产物（目的片段）回收
• 2.1.6 DNA片段的连接和转化
• 2.1.7 碱法少量提取重组质粒
• 2.1.8 重组质粒的鉴定
• 2.1.9 序列测定及分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 PVA部分核苷酸序列的测定
• 2.2.1.1 RT-PCR扩增结果
• 2.2.1.2 测序鉴定和同源性分析结果
• 2.2.2 PVX部分核苷酸序列的测定
• 2.2.2.1 RT-PCR扩增结果
• 2.2.2.2 测序鉴定和同源性分析结果
• 2.2.3 PVY部分核苷酸序列的测定
• 2.2.3.1 RT-PCR扩增结果
• 2.2.3.2 测序鉴定和同源性分析结果
• 2.2.4 PLRV部分核苷酸序列的测定
• 2.2.4.1 RT-PCR扩增结果
• 2.2.4.2 测序鉴定和同源性分析结果
• 2.2.5 PVS部分核苷酸序列的测定
• 2.2.5.1 RT-PCR扩增结果
• 2.2.5.2 测序鉴定和同源性分析结果
• 2.2.6 PSTVd部分核苷酸序列的测定
• 2.2.6.1 RT-PCR扩增结果
• 2.2.6.2 测序鉴定和同源性分析结果
• 2.2.7 CMV部分核苷酸序列的测定
• 2.2.7.1 RT-PCR扩增结果
• 2.2.7.2 测序鉴定和同源性分析结果
• 2.2.8 TMV部分核苷酸序列的测定
• 2.2.8.1 RT-PCR扩增结果
• 2.2.8.2 测序鉴定和同源性分析结果
• 2.2.9 18S rRNA部分核苷酸序列的测定
• 2.2.9.1 RT-PCR扩增结果
• 2.2.9.2 测序鉴定和同源性分析结果
• 2.3 小结
• 第三章 病毒粒子直接吸附—反转录—聚合酶链式反应检测马铃薯病毒
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 毒源
• 3.1.2 马铃薯样品
• 3.1.3 病毒RNA制备的优化
• 3.1.4 病毒特异引物的设计和合成
• 3.1.5 RT-PCR
• 3.1.6 克隆和测序
• 3.1.7 病毒RNA保存期限的测定
• 3.1.8 VDA-RT-PCR和免疫捕捉RT-PCR的灵敏度比较
• 3.2 结果和分析
• 3.2.1 病毒RNA制备的优化结果
• 3.2.1.1 四种病毒提取缓冲液的比较结果
• 3.2.1.2 不同孵育时间对病毒粒子在离心管表面结合的影响
• 3.2.1.3 不同变性温度对病毒RNA释放的影响
• 3.2.2 病毒RNA保存期限的测定结果
• 3.2.3 灵敏度比较结果
• 3.2.4 马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒3'末端核酸序列扩增的结果
• 3.2.5 VDA-RT-PCR检测田间马铃薯样品的结果
• 3.3 讨论
• 第四章 以18S RRNA作为内参照同时检测5种马铃薯病毒的多重RT-PCR体系的优化和应用
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 毒源
• 4.1.2 马铃薯样品
• 4.1.3 总RNA的提取
• 4.1.4 引物设计和合成
• 4.1.5 单个病毒反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 4.1.6 nad2 mRNA部分序列的RT-PCR扩增
• 4.1.7 nad2 mRNA部分序列的克隆和测序
• 4.1.8 18S rRNA与nad2 mRNA的灵敏度和稳定性比较
• 4.1.9 多重RT-PCR的优化
• 4.1.10 双夹心-酶联免疫吸附试验（DAS-ELISA）
• 4.1.11 多重RT-PCR和DAS-ELISA的检测极限的比较
• 4.2 结果
• 4.2.1 nad2 mRNA部分核苷酸序列的扩增和克隆测序
• 4.2.2 18S rRNA与nad2 mRNA的比较结果
• 4.2.3 多重RT-PCR的优化
• 4.2.4 优化的多重RT-PCR与DAS-ELISA的检测极限比较
• 4.2.5 田间马铃薯样品的检测结果
• 4.3 讨论
• 第五章 用于同时检测7种马铃薯病毒和1种类病毒的寡聚核苷酸微点阵的制备
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 病毒和类病毒
• 5.1.2 马铃薯样品
• 5.1.3 总RNA的提取
• 5.1.4 引物和寡聚核苷酸探针的设计和合成
• 5.1.5 RT-PCR
• 5.1.6 多重PCR的建立
• 5.1.7 CY5荧光标记
• 5.1.8 寡核苷酸微芯片的构建
• 5.1.9 寡核苷酸微芯片的杂交
• 5.1.10 扫描和数据分析
• 5.1.11 RNA核酸斑点杂交
• 5.1.12 寡聚核苷酸微点阵与核酸斑点杂交的检测灵敏度比较
• 5.2 结果
• 5.2.1 RT-PCR扩增结果
• 5.2.2 不同杂交温度对杂交效率的影响和杂交的特异性
• 5.2.3 多重标记PCR的建立
• 5.2.4 寡聚核苷酸微点阵和RNA核酸斑点杂交的检测灵敏度比较
• 5.2.5 不同CMV分离物的寡聚核苷酸微点阵检测结果
• 5.2.6 田间样品的杂交检测结果
• 5.3 讨论
• 第六章 一种高通量玻片杂交方法的建立与应用
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 病毒和类病毒
• 6.1.2 TMV病毒粒子的提取
• 6.1.3 病毒cDNA克隆和引物
• 6.1.4 总RNA提取
• 32P标记的探针进行尼龙膜杂交'>6.1.5 用³²P标记的探针进行尼龙膜杂交
• 6.1.6 用荧光染料CY5标记的探针进行玻片杂交
• 6.1.6.1 RNA样品的点样
• 6.1.6.2 CY5标记探针的制备
• 6.1.6.3 玻片杂交
• 6.1.6.4 玻片扫描和数据分析
• 6.1.7 不同点样缓冲液对RNA结合效率的影响
• 6.1.8 不同修饰类型的玻片对RNA结合效率的影响
• 6.1.9 玻片杂交和尼龙膜杂交的检测灵敏度比较
• 6.2 结果
• 6.2.1 不同点样液对RNA结合效率的影响
• 6.2.2 不同修饰类型的玻片对RNA结合效率的影响
• 6.2.3 玻片杂交和尼龙膜杂交检测灵敏度的比较
• 6.2.4 玻片杂交的特异性检验
• 6.2.5 田间马铃薯样品的检测结果
• 6.3 讨论
• 总结
• 参考文献
• 附录1.重要溶液的配制
• 附录2.在读博士研究生期间发表和投稿中的研究论文