hTERT基因修饰的椎间盘髓核细胞永生化研究及干细胞样髓核细胞的分离鉴定

论文摘要

大约有70%-85%的人在一生中都有腰背痛（Low Back Pain, LBP）的经历,腰背痛及其随之而来的疾病非常普遍。一般认为椎间盘退变（Intervertebral Disc Degeneration, IVDD）是腰背痛的主要原因,椎间盘组织包括三个高度特殊化的结构:软骨终板（Cartilage End-plate, CEP）、纤维环（Anulus Fibrosus, AF）和髓核（Nucleus Pulposus, NP）。在椎间盘退变过程中,首先是从髓核的变化开始的。髓核是全身最大的无血管组织,且细胞数量有限,发生病变后难以自身修复,目前常规的手术治疗方法并不能使椎间盘的功能恢复。随着体外椎间盘髓核及纤维环组织细胞培养技术的建立,随着对不同物种椎间盘细胞的研究以及软骨组织工程研究的不断深入,为退变椎间盘的形态结构与生理功能的再生修复带来了希望。以髓核细胞为来源的组织工程学研究已成为生物学治疗椎间盘退变的一个方向,在组织工程学研究中,种子细胞的培养是基本环节。然而由于普通髓核细胞生长缓慢、培养技术复杂,要想获得大量的髓核细胞非常困难,再加上目前对于髓核细胞的表型鉴定仍未达成共识,所有这些都成为限制髓核组织工程学研究的因素。我们采用经基因工程修饰的椎间盘髓核细胞作为种子细胞,期望获得大量的性状稳定的髓核细胞,因此选择慢病毒介导hTERT（human Telomerase Reverse Transcriptase端粒酶逆转录酶）基因感染髓核细胞使其永生化帮助解决细胞来源问题。我们在髓核细胞培养过程中发现很多形态类似于间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell, MSC）的梭形细胞,这些细胞的增殖特性较好,有的可以连续传代至第十代仍能保持良好的生长状态。因此我们对这些梭形细胞根据干细胞鉴定标准进行了鉴定。初步验证了从椎间盘髓核组织分离和鉴定髓核来源干细胞（Nucleus Pulposus derived Mesenchymal stem cells, NP-MSC）的设想。在此基础上,进一步比较了髓核细胞与NP-MSC的细胞特性以及同一个体NP-MSC和骨髓来源干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSC）的细胞特性。实验共分四个部分:第一部分:hTERT慢病毒包装与滴度测定第一部分实验通过PCR以质粒pMD18-T-hTERT为模板扩增得到目的基因hTERT,将慢病毒真核表达载体pGC-FU-EGFP-3FLAG大量提纯,经限制性内切酶AgeI和NheI酶切线性化并纯化,在交换酶的作用下,将目的基因交换连接入纯化的线性化载体中,氯化钙法转化大肠杆菌DH5α,长出的克隆采用菌落PCR进行筛选鉴定。筛选出的阳性转化子克隆放大培养后测序,测序结果表明阳性克隆中的目的基因与原hTERT基因序列完全一致,证明得到了hTERT慢病毒真核表达载体pGC-FU-TERT,准备用于病毒包装。复苏并传代病毒包装细胞293T（选用对数生长期）,采用Lipofectamine2000试剂将三质粒（pGC-FU-hTERT,pHelper1.0,pHelper2.0）共转染293T,48小时后收集细胞培养上清液,即为病毒粗提液,经高速离心装置浓缩为病毒浓缩液,用Real Time荧光定量PCR法测定病毒浓缩液滴度为2E+8 TU/mL,并且通过Western Blot方法验证了包装细胞中目的基因hTERT的表达,证明得到了较高滴度的浓缩慢病毒液Lenti-hTERT。这是下一步感染人髓核细胞的前提。第二部分:慢病毒介导hTERT感染椎间盘髓核细胞及其验证第二部分实验首先取行前路矫正手术的特发性脊柱侧凸患者的髓核组织2例（10岁和14岁）,采用酶法分离培养正常人髓核细胞。经过细胞形态观察,免疫组化测定Ⅱ型胶原的表达,和流式细胞术检测CD24的表达来鉴定髓核细胞。分离到的髓核细胞为多边形,免疫组化ABC法Ⅱ型胶原染色为阳性,CD24表达阳性,表明成功分离培养出正常人髓核细胞。然后用Lenti-GFP进行预实验,将滴度为2E+9 TU/mL的病毒液按照不同滴度,即按照不同MOI（分别为100、50、10、1）对分离培养的人椎间盘髓核细胞进行感染,并且分为加polybrene组和不加polybrene组,分别测定其感染参数和感染条件,感染后继续传代,利用荧光显微镜观察绿色荧光,采用流式细胞术测定其感染效率。结果显示慢病毒在人髓核细胞中的感染条件和感染参数为:不需要添加polybrene,MOI为100时感染效果较好。感染Lenti-GFP的人髓核细胞经连续传代至第五代时,测得其GFP表达比例仍保持在60%以上,证明了慢病毒介导GFP的基因感染在髓核细胞中可以持续稳定表达。为慢病毒感染髓核细胞奠定基础。浓缩包装好的Lenti-hTERT慢病毒,按照上述感染条件感染正常人髓核细胞,感染后的细胞在蛋白水平进行Western Blot检测有端粒酶的表达,而且端粒酶的活性明显提高,与未感染组对比,其传代特性有明显的改善,可以传代至十五代以上,普通髓核细胞传至第五代左右即出现了“去分化”现象。同时感染后细胞仍然具有髓核细胞的基本特性:形态学观察一致,免疫组化染色Ⅱ型胶原阳性,流式细胞术测定CD24表达阳性。由于Lenti-hTERT构建中不含GFP,我们通过多次传代的方法来筛选阳性细胞。经过连续传代后,随着传代次数的增加,留下来的细胞则越来越多的是感染hTERT的细胞,我们用来验证端粒酶表达的细胞是经过传代10代以上的细胞。实验证明我们得到了永生化的髓核细胞。同时,裸鼠致瘤性实验结果证实Lenti- hTERT感染的髓核细胞对裸鼠没有致瘤性。为我们以慢病毒为基因载体进行基因工程修饰的人髓核细胞作为种子细胞提供了实验依据。第三部分:椎间盘髓核细胞与髓核来源干细胞的特性比较第三部分实验从7例进行各种椎间盘手术的患者（5例脊柱侧凸、2例椎间盘退变）髓核组织中分离培养和鉴定了髓核来源干细胞（Nucleus Pulposus-Mesenchymal Stem Cell, NP-MSC）。取第五代大多数为梭形的细胞,同时与前两代大多数为多边形的细胞作比较,每次实验均从培养瓶中挑选较大和生长良好的细胞克隆作为研究用细胞。首先观察细胞形态;然后通过流式细胞术测定NP-MSC的干细胞相关阳性标志:CD105、CD29和CD44,阴性标志:CD34、CD14、CD45和HLA-DR,以及髓核细胞相关阳性标志CD24;荧光定量PCR法测定两种细胞Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和SOX9的相对表达量;最后进行多向分化能力鉴定:成骨、成脂和成软骨分化能力鉴定。结果显示:从髓核组织中分离培养的梭形细胞,形态与骨髓等来源的MSC非常相似,增殖性好,经多次传代后细胞形态保持不变;而多边形细胞在传至五代左右出现“去分化”,趋向衰老,增殖性差。梭形细胞的干细胞相关阳性标志CD105、CD29和CD44均为阳性,而CD34、CD14、CD45、HLA-DR及CD24表达均为阴性;多边形细胞除了CD24表达为部分阳性（50-70%）外,CD29、CD44也是部分阳性,其余抗原均为阴性。多向分化实验中梭形细胞可以向成骨、成软骨和成脂方向诱导（除了一例37岁标本不能成脂）;多边形细胞在加入诱导液之后很快细胞出现大量死亡,说明其不具有多向分化能力。在我们的病例中,10岁和14岁的两例NP-MSC都可以培养传代到10代,而其他病例大多培养到5-6代细胞开始趋向衰老。在前两代大多是多边形的细胞,当传代至第四代之后,梭形的干细胞样细胞逐渐增多,而多边形的细胞逐渐减少。因此,我们认为:多边形的细胞很可能是髓核细胞;梭形细胞在传代过程中,细胞形状基本保持不变,具有多向分化能力和干细胞标志,是髓核来源的干细胞。第四部分:髓核组织来源干细胞与骨髓来源干细胞特性比较第四部分实验选取3例同一个体来源的髓核干细胞与骨髓干细胞进行对比,首先是细胞形态观察,传代周期比较（将2×105细胞数接种于25cm2培养瓶,细胞融合达到90%时为一代,胰酶消化后继续同样的传代操作）,然后采用流式细胞术测定干细胞标志CD105、CD29和CD44,最后是成骨、成脂及成软骨的多向分化能力比较。结果显示:同一个体两种来源的干细胞形态类似,均为长梭形贴壁生长;二者传代周期有差异:NP-MSC每次传代需要6-9天,而BMSC每代需要4-6天,年龄较大病例的NP-MSC传代周期更长,可到10天以上;对于NP-MSC和BMSC的免疫表型,两种干细胞的CD105、CD29和CD44三个抗体表达检测均为阳性,但是NP-MSC这三个抗体的平均荧光强度（Mean Fluorescence Intensity, MFI）都比BMSC弱,其余阴性抗体（CD34、CD45、CD14和HLA-DR）二者表达均为阴性。在诱导成骨分化过程中未观察到两种干细胞的明显区别,均可在诱导14天-18天观察到成骨钙结节。在诱导软骨分化过程中发现,收集相同细胞数形成的细胞沉淀,在诱导3-6天时即发现NP-MSC形成了软骨样圆形小球,而BMSC在12天以后逐渐开始形成圆球状。二者可能在软骨诱导方面有差异。成脂诱导观察:BMSC在普通倒置显微镜下观察到脂滴形成的时间很短,8天左右不须染色即可观察到明显的脂滴,而NP-MSC在12天时观察仍不十分清楚,诱导16天以上通过染色可以看到有脂滴形成,但是发现形成脂滴的细胞很快死亡崩解（图4-7）,说明该细胞在成脂诱导过程中成活力比BMSC差。结论:1.成功构建了hTERT基因慢病毒表达载体pGC-FU-hTERT,以293T为包装细胞,得到了浓缩的高滴度慢病毒Lenti-hTERT。2.慢病毒Lenti-hTERT可以成功感染髓核细胞并表达端粒酶,修饰后的髓核细胞可以稳定传代并仍具有髓核细胞的基本特性,得到的永生化髓核细胞可以作为髓核组织工程学种子细胞。3.从椎间盘髓核组织中成功分离了干细胞样的细胞,并初步鉴定其具有干细胞特性。4.髓核组织中分离而来的多边形细胞与干细胞样细胞在形态、细胞表型、细胞外基质分泌等方面有明显差异。说明髓核组织中可能既存在髓核细胞,又存在髓核组织干细胞;5.同一个体中髓核来源与骨髓来源干细胞可能在软骨分化和成脂分化方面存在差异。因此髓核来源干细胞作为组织工程学研究的一种新的种子细胞可能在软骨诱导方面有较大应用价值。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 前言
• 第一部分 hTERT 慢病毒包装与滴度测定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 慢病毒介导hTERT 感染椎间盘髓核细胞及其验证
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 髓核细胞与髓核组织来源干细胞的特性比较
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分 髓核来源干细胞与骨髓来源干细胞的特性比较
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 个人简介
• 致谢