论文摘要
本论文以辽宁本溪县产刺嫩芽为原料,系统研究了刺嫩芽皂甙的提取纯化方法与条件、刺嫩芽皂甙基本性质、β-葡萄糖苷酶处理对皂甙影响及酶处理后刺嫩芽皂甙生理活性的提高程度,确定出了刺嫩芽皂甙的提取纯化工艺和降低毒性提高活性的方法,扩大了刺嫩芽皂甙的应用范围,提高了刺嫩芽的经济价值。得到主要结论如下:确立了齐墩果酸作为标准品的波长为291nm的皂甙紫外检测方法,证明了刺嫩芽含有丰富的齐墩果酸类皂甙,可以用齐墩果酸含量计算出刺嫩芽皂甙的总量。极差分析提取正交试验因素的影响大小关系顺序为:提取温度＞提取时间＞固液比＞乙醇浓度,最佳条件为浸提温度70℃、浸提时间3h、固液比1:20、乙醇浓度90%,最大提取率为:8.1%。超声波处理正交试验结果表明:影响超声波辅助提取皂甙的因素从大到小排列依次是料液比、温度、超声波处理时间、乙醇浓度,当料液比为1:20,温度为65℃,超声波时间为20min,乙醇浓度为100%,刺嫩芽皂甙提取率最大为8.7%。刺嫩芽粗皂甙经过4次氯仿脱蛋白处理后,脱去了81.9%的蛋白质。经木瓜蛋白酶正交试验极差分析,影响因素从大到小排列顺序依次为:温度、酶量、处理时间、pH值,最佳处理条件为温度50℃、酶用量为2%、酶解2h、pH为6.0,又脱去剩余蛋白的80.2%,蛋白质浓度降到0.4mg/mL。AB-8树脂对刺嫩芽皂甙的吸附量达63.9mg/g,解吸率为96.5%,当解吸液体积为400mL,乙醇浓度为70%,流速为0.6mL/min,pH值为8.0时,AB-8大孔树脂对刺嫩芽皂甙的纯化效果最好。用硅胶柱层析分离刺嫩芽皂甙的不同组分得到6份样品,质量比例为:34.3%、21.1%、16.9%、15.1%、7.9%、4.7%。泡沫试验、Liebermann反应、三氯化锑-氯仿饱和溶液反应、TCL检测试验都证明了刺嫩芽提取物里面含有丰富的皂甙成分。硅胶薄层层析证明刺嫩芽皂甙的单糖可能由鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖和木糖组成,这为酶水解提高刺嫩芽皂甙活性研究提供了依据。确立了215nm为检测波长,乙腈与水为流动相梯度洗脱的HPLC皂甙组分检测条件,发现样品1、2、3中含有4个单体物质;样品4、5中含有5个单体物;样品6中含有6个单体物质。6个皂甙样品中都含有齐墩果酸,齐墩果酸保留时间为14.7min。确立了HPLC检测齐墩果酸含量的方法条件为波长215nm、乙腈和水等度洗脱,齐墩果酸保留时间为7.0min。6个样品的齐墩果酸含量分别为45.6%、36.1%、31.4%、10.7%、26.6%、25.5%,精总皂甙里的齐墩果酸含量为33.5%。紫外吸收表明,刺嫩芽总皂甙有六个比较明显的吸收峰,其中在299nm处的吸收峰最大,说明总皂甙中含有多个皂甙单体,分子比较大;皂甙样品1到皂甙样品6六个皂甙样品中有多个明显吸收峰,吸收峰逐渐向长波附近集中,说明皂甙单体分子逐渐变大,极性减弱。红外吸收表明:皂甙组分的波形都非常相近,经过基础图谱分析可以发现皂甙中含有脂肪烃、脂肪族伯醇、脂肪族仲醇等官能团,样品1与2还含有脂肪酸官能团,经详细图谱检索,说明皂甙含有带羟基的长碳链、异麦芽糖和β-D-半乳糖。β-葡萄糖苷酶水解正交试验极差分析表明,影响程度依次为酶解温度＞酶用量＞酶解时间,三因素的最佳水平为:酶解温度为40℃,酶用量为3.0mg,酶解时间为120min。经β-葡萄糖苷酶酶解后刺嫩芽皂甙以甲醇为洗脱剂用硅胶柱分离,共收集6份样品,质量比例为:34.8%、24%、11.8%、11.3%、8.1%、10.0%。经进样量10μL;流动相甲醇与水70:30等度洗脱;流速为1.0mL/min,检测波长215nm,柱温为25℃的高效液相色普检测,β-葡萄糖苷酶酶解后样品E1、E2、E3中含有4个分离比较好的基本单体物质,样品E4、E5、E6中含有5个单体物质,样品都含有齐墩果酸,保留时间为5.1min。酶解后刺嫩芽皂甙在紫外检测条件下仍然含有多个吸收峰,但吸收明显向低波长靠近,多数在236nm处的吸收峰最大,说明酶解后皂甙中单体分子明显变小,单体数量减少。红外吸收表明:酶解后皂甙的波形都非常相近,经过基础图谱分析可以判断皂甙中含有脂肪烃、脂肪族伯醇、脂肪族仲醇、脂肪族伯胺、脂肪酸盐等官能团,说明酶水解掉部分单糖,裸露出了羧基与长的碳链。含有带羟基或氨基的长碳链、烯酸结构、异麦芽糖、β-D-苯基葡糖苷、甘露醇、苯甲酸和β-D-半乳糖成分。皂甙溶液在较低浓度时对羟基自由基与氧自由基就有一定的清除作用,自由基的清除效果与皂甙的浓度呈显著正相关性。解酒与防醉试验表明,刺嫩芽皂甙具有抑制乙醇吸收作用,从而能够显著延长酒精耐受时间,降低醉酒维持时间,有解酒防醉保护肝脏效果。体内抗氧化试验表明,刺嫩芽皂甙可以提高小鼠SOD活性,降低小鼠体内组织的MDA含量。刺嫩芽皂甙能够提高小鼠的脾脏指数与胸腺指数,增强小鼠的免疫能力;也可以降低血清中的总脂、总胆固醇,提高血清中高密度脂蛋白。刺嫩芽皂甙只是在一定程度上调解正常小鼠的血糖与胰岛素水平;显著降低高血糖模型小鼠的血糖值,显著提高高血糖模型小鼠的胰岛素水平,对于高血糖具有非常好的治疗作用。经β-葡萄糖苷酶酶解后的皂甙活性更加显著,说明β-葡萄糖苷酶可以提高刺嫩芽皂甙活性。