假单胞菌精氨酸脱亚胺酶的发酵制备与活性研究

论文摘要

精氨酸脱亚胺酶（arginine deiminase,简称ADI）途径每分解一分子精氨酸可产生一分子ATP,是一些微生物的主要能量来源。ADI催化该途径中的第一步反应,即将精氨酸降解为瓜氨酸和氨气。对于人类而言精氨酸属于非必需氨基酸,正常的细胞核组织可通过瓜氨酸在精氨酸-琥珀酸（ASS）合成酶下作用下合成,而一些人类癌细胞不表达ASS,从而不能从瓜氨酸合成精氨酸。因此,精氨酸脱亚胺酶有可能从根本上消灭或控制精氨酸缺陷型肿瘤,如黑色素癌和肝癌等。以往在ADI的制备中,多采用的是支原体（Mycoplasma arginini）,在生物安全性方面存在一定的隐患。采用本实验室自行筛选的假单胞菌（Pseudomonas）制备ADI,使用优化后培养基,葡萄糖10 g/L,酵母膏5 g/L,蛋白胨4 g/L,精氨酸盐酸盐8 g/L,初始pH 7.0,接种量4%,装液量60/250 mL摇瓶,转速190 rpm,培养温度30℃,24 h后单位发酵液酶活由优化前的1.34 U/mL提高到1.82 U/mL,提高35%;在5 L发酵罐扩大培养中,酶活上升至2.17 U/mL,提高57%,达到了良好的产酶效果。经过硫酸铵盐析、透析、DEAE Sephadex A-50离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析等一系列手段纯化ADI,纯化后的蛋白样品经SDS-PAGE证实为单一条带,分子量约为54 kDa。最终ADI酶活得率为5.8%,提纯倍数为11.0,比酶活为5.28 U/mg。初步验证了ADI的体内和体外的抗癌活性。ADI粗酶在体外对HepG2的抑制率在0.5 U/mL时达93.4%;纯化后ADI对肝癌细胞HepG2的抑制率在0.03 U/mL时达23.4%;ADI粗酶在两周合计给药5 U组别中,对肝癌细胞H22细胞的抑制率达到82.3%,对免疫器官的伤害最小。以上三部分实验均显示了ADI作为有效的抗癌药物的潜力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 精氨酸脱亚胺酶（ARGININE DEIMINASE, ADI）简介
• 1.1.1 精氨酸脱亚胺酶的生物学意义
• 1.1.2 精氨酸脱亚胺酶的理化性质
• 1.2 精氨酸脱亚胺酶的用途
• 1.2.1 用于某些精氨酸缺陷型癌症的治疗
• 1.2.2 用于白血病的治疗
• 1.2.3 用于鼠科淋巴瘤的治疗
• 1.2.4 用于乳腺癌的治疗
• 1.2.5 在口腔中的作用
• 1.2.6 用于转化精氨酸生成瓜氨酸
• 1.3 精氨酸脱亚胺酶的国内外研究进展
• 1.3.1 精氨酸脱亚胺酶的重组表达研究
• 1.3.2 精氨酸脱亚胺酶的活性研究
• 1.4 本课题的立题意义与研究内容
• 1.4.1 立题意义
• 1.4.2 研究内容
• 第二章 精氨酸脱亚胺酶酶活检测方法的建立
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 改良后二乙酰一肟-硫氨脲法测定条件的确定
• 2.3.2 改良后二乙酰一肟-硫氨脲法相关特性
• 2.4 本章小结
• 第三章 精氨酸脱亚胺酶的发酵制备
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 主要仪器
• 3.2.5 培养方法
• 3.2.6 分析方法
• 3.3 结果和讨论
• 3.3.1 培养基不同碳源对发酵产酶的影响
• 3.3.2 培养基不同氮源对发酵产酶的影响
• 3.3.3 培养基中诱导物对发酵产酶的影响
• 3.3.4 发酵温度和初始pH 值对发酵产酶的影响
• 3.3.5 接种量、装液量对发酵的影响
• 3.3.6 假单胞菌产酶发酵曲线
• 3.4 本章小结
• 第四章 精氨酸脱亚胺酶的分离纯化
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 主要试剂
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 实验方法
• 4.2.4 分析方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 盐析中硫酸铵浓度的确定
• 4.3.2 离子交换层析最适pH 的确定
• 4.3.3 离子交换层析最适离子强度的确定
• 4.3.4 离子交换层析结果
• 4.3.5 凝胶过滤层析结果
• 4.3.6 SDS-PAGE 蛋白电泳鉴定
• 4.4 本章小结
• 第五章 精氨酸脱亚胺酶的活性研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 主要试剂
• 5.2.2 主要仪器
• 5.2.3 实验方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 粗酶体外活性实验
• 5.3.2 纯化后ADI 体外活性实验
• 5.3.3 粗酶体内活性实验
• 5.4 本章小结
• 第六章 结论与展望
• 总结
• 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文