东南景天锌超积累过程中基因表达差异的cDNA-AFLP分析

论文摘要

由于重金属超积累植物在治理重金属污染土壤方面,有广阔的应用前景,已引起国际土壤——植物营养学界和环境科学界的浓厚情趣和政府部门的高度重视。但目前对植物超积累重金属机制认识的不足限制了该技术的应用和改良。东南景天（Sedum alfredii Hance）是在我国东南部地区一些古老的铅锌矿区发现的一种新的锌/镉超积累植物,同时对铅具有富集作用。本研究以超积累东南景天为材料,以其他近缘种为对照,分析了铅锌矿区东南景天在长期的重金属胁迫条件下,进化成超积累植物后的基因组变异情况;以及利用cDNA-AFLP技术对超积累生态型东南景天在锌超积累过程中的基因表达差异进行研究;另外还采用水培方法,观察超积景天在锌镉积累过程中的GSH、H2O2、总硫含量随锌镉积累量的变化,探讨了GSH和H2O2在超积累过程中的作用,取得的主要研究结果如下:1.植物长期生长在重金属污染的生境中,逐渐进化成不同的生态型,利用我国原生的Zn/Cd超积累生态型东南景天（Hyperaccumulated ecotype:HE）为材料,以与其亲缘关系较近的非超积累生态型东南景天（NHE）、圆叶景天（Sedum MakinoiMaxim:SMM）、凹叶景天（Sedum emarginatum Migo:SEM）、垂盆草（SedumSarmentoum Bunge:SSB）以及株芽景天（Sedum Bulbiferum Makino:SBM）为对照,利用RAPD方法,研究超积累生态型东南景天基因组变异的程度,并对部分超积累景天特有的PCR条带进行测序,分析特异基因片段与超积累的关系。遗传进化树分析表明:六种不同生态型的景天可以分成两组,其中两种东南景天为一组,另外四种为一组;超积累生态型和野生型东南景天有着相似的遗传背景,相似系数显示变异程度已超过种的界限。说明污染土壤对植物的进化有着非常大的影响;部分超积累景天特异PCR片段测序表明,ATP-硫酰化酶（ATP sulfuryase）、脱水调节相关蛋白及一些未知基因片段可能与超积累性状有一定的关系。2.植物对重金属锌/镉超积累与过氧化氢产生关系的研究表明,在1000uM Zn2+或200uM Cd2+处理条件下,超积累生态型东南景天地上部Zn2+的积累量高于Cd2+的积累量。地上部Zn2+/Cd2+积累时间动力学显示在前15天,呈线形增加,随后积累速度下降。同样,地上部总硫、GSH以及H2O2的含量也是在前15天迅速增加,后10天逐渐下降。总硫和GSH的含量都是Cd2+处理下较Zn2+处理的高,而H2O2的含量则是Cd2+处理下较Zn2+处理的低;地上部Zn2+含量变化与地上部GSH、总硫及H2O2变化趋势相似,而Cd2+则是在第5天时含量就达到最大,以后开始逐渐下降。以上结果推测:含硫有机物可能不是超积累生态型东南景天Zn2+/Cd2+积累的主要配体,GSH的功能主要是解除体内游离态Zn2+/Cd2+的毒性,H2O2很可能是与超积累相关的一种信号分子。增加硫元素的供应对提高zn2+/Cd2+的积累有一定的作用;东南景天对Zn2+和Cd2+的吸收和积累存在不同的调控机制。3.为方便比较锌超积累生态型东南景天在不同条件下的基因表达差异,需要克隆一个稳定表达的基因作为对照。在本试验中,利用设计的兼并引物通过PCR方法获得了一段actin基因的序列,然后根据获得的序列再通过3′-RACE和5′-RACE方法,得到了全长的actin基因序列;克隆得到的actin基因全长为1418bp,预测的编码区域为1131bp,编码377个氨基酸。4利用cDNA-AFLP（cDNA扩增长度片段多态性:cDNA-amplified fragment lengthpolymorphism）方法,研究了我国原生的东南景开在锌超积累过程中的基因表达差异。结果表明:随着处理时间的增加,地上部锌含量也呈逐渐增加趋势;在5个时间点的多态性电泳图中,共出现4000多个条带,其中约有100个左右的转录差异片段（TDFs:transcript-derived fragments）,并成功克隆了87个TDFs。;经数据库对比分析,其中有47个与已知或假定的基因存着明显的同源性,6个与未知功能的基因有同源性,34个与数据库中现有的基因没有明显的相似性。随机地从87个克隆片段中的选取23个做Real-time PCR验证,有16个表达谱与cDNA-AFLP完全相同;在38个与现有已知功能基因相似的片段中,按照功能可分成转录因子、胁迫响应、转录促进、细胞和组织代谢、光合作用、表达调节以及混合功能等几类;34个没有同源性的和15个与未知功能基因（假定的基因和未知功能的基因）同源的加在一起共有49个,占总数87个的56.3%。说明植物的超积累能力,与许多目前尚不清楚的基因有关。在38个能通过BLAST方法确定具体功能的TDFs中,包含有信号转导、胁迫响应、转录因子、表达调节等各种类型,表明东南景天锌超积累过程需要各种类型的酶系参与,锌超积累性状的形成包括复杂的信号通路和生理生化代谢途径。

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第一部分文献综述

一植物超积累的分子机制

引言

1.超积累植物的概念

2 植物对重金属超积累的分子机制

2.1 根系对重金属的吸收转运

2.2 重金属在地上部组织细胞内的分区

2.3 胁迫伤害修复

3 分子生物学在植物修复领域的应用

3.1 硫代谢相关基因

3.2 植物络合素合成关键酶基因

3.3 有机汞裂解酶基因

3.4 其他相关基因

二 RAPD技术在植物基因变异分析中的应用

1.RAPD技术简介

2RAPD技术应用概况

三 cDNA-AFLP技术及其应用

1.cDNA-AFLP技术的原理与方法

2.cDNA-AFLP技术的特点

2.1 cDNA-AFLP指纹技术重复性高

2.2 可准确地反映基因间表达量的差异

3 cDNA-AFLP技术的应用

3.1 基因表达特性的研究

3.2 遗传标记分析

3.3 分离特异表达的基因

第二部分试验部分

第一章超积累东南景天基因组变异的RAPD分析

前言

1 材料和方法:

1.1 土壤和植物材料的收集

1.2 土壤及植物重金属含量分析

1.3 DNA的提取和RAPD扩增

1.4 RAPD数据分析

1.5 HE特异PCR条带的回收、测序与blast分析

2.结果

2.1 土壤及植物重金属含量分析

2.2 RAPD数据分析

2.3 HE特异PCR序列的功能分析

3.讨论

2O₂在超积累过程中的作用分析'>第二章.GSH、硫元素及H₂O₂在超积累过程中的作用分析

前言

1.材料和方法

1.1 植物材料

1.2 实验设计

1.3 测定方法

2.结论

2.1 Zn/Cd含量的变化

2.2 GSH含量的变化

2.3 总硫含量的变化

2O₂含量的变化'>2.4 H₂O₂含量的变化

2O₂定位'>2.5 Zn/Cd积累诱导的H₂O₂定位

2.6 硫供应水平对地上部锌/镉积累能力的影响

3.讨论

第三章.东南景天锌积累过程中基因表达差异的cDNA-AFLP分析

前言

1 材料和方法

1.1 材料培养及处理

1.2 Zn含量测定

1.3 总RNA提取、mRNA纯化和cDNA合成

1.4 模板制备以及cDNA-AFLP分析

1.5 cDNA-AFLP差异片段的克隆

1.6 Real-time PCR分析

2 结果与分析

2.1 Zn含量

2.2 cDNA-AFLP的分析

2.3 锌积累过程中的基因表达模式和TDFs功能分类

2.4 Real-time PCR结果分析

3.讨论

第四章综合讨论与结论

4.1 超积累东南景天基因组变异的RAPD分析

2O₂在超积累中的作用分析'>4.2 GSH、总硫及H₂O₂在超积累中的作用分析

4.3 锌超积累过程中基因表达差异的cDNA-AFLP分析

4.4 锌超积累相关的基因类型分析

参考文献

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