枯草芽孢杆菌224 yplQ、ytjAa基因缺失菌株的构建及对其溶血性影响

论文摘要

枯草芽孢杆菌224（Bacillus subtilis 224,BS224）是一种从人体中分离出来的非致病性芽孢杆菌,根据微生态学原理,利用微生物间的拮抗作用,由其活菌体制成的生物制品白天鹅气雾剂是一种有效治疗烧伤创面感染、促进创面愈合的烧伤外用药,但由于具有溶血性能,目前,已经停止了其在医疗方面的使用。目前,国内外还没有枯草芽孢杆菌224基因组序列的相关报道,但枯草芽孢杆菌168基因组全碱基序列已经确定,其中8个基因可能与溶血有关,yplQ（642bp）、ytjAα（228bp）为其中的两个,并且ytjAα为α溶血素样基因。本实验是根据枯草芽孢杆菌168基因组序列设计引物,以枯草芽孢杆菌224染色体DNA为模板,利用PCR技术扩增了yplQ、ytjAα两个基因,并将它们分别插入到克隆载体pMD18-T中,构建了重组质粒pMD18-T-yplQ、pMD18-T-ytjAα。连接产物转化入大肠杆菌JM109感受态中,并从含氨苄青霉素抗性平板上筛选出阳性克隆,对阳性重组子进行酶切鉴定和测序分析。结果表明所克隆的yplQ、ytjAα基因核苷酸序列与Genbank上已发表的序列同源性分别为99.8%、99.4%,因此可以确定枯草杆菌224的基因组中yplQ、ytjAα基因克隆正确。以枯草芽孢杆菌224染色体DNA为模板,用PCR方法分别扩增yplQ基因上游约1.0kb和基因中的下游0.5kb的两段DNA序列作为打靶载体的同源长、短臂,将此两段序列按同一方向分别插入骨架质粒pMD18-T-neo中新霉素抗性基因（neor）表达单元的5’端和3’端,构建成重组质粒pMD18-T-neo-yplQ作为基因打靶载体。将构建好的yplQ基因打靶载体用HindⅢ单酶切线性化后,电转化至枯草芽孢杆菌224感受态中,50μg·ml-1新霉素抗性平板筛选。利用PCR鉴定方法筛选yplQ基因缺失株,检测36个抗性转化子确定基因缺失株。以枯草芽孢杆菌224染色体DNA为模板,用PCR方法分别扩增ytjAα基因下游约0.5kb和上游约0.4kb的两段DNA序列作为打靶载体的同源长、短臂,将此两段序列按同一方向分别插入骨架质粒pMD18-T-neo新霉素抗性基因（neor）表达单元的3’端和5’端,构建成重组质粒pMD18-T-neo-ytjAα作为基因打靶载体。将构建好的ytjAα基因打靶载体用PstⅠ、EcoRⅠ双酶切线性化后,电转化至枯草芽孢杆菌224感受态中,50μg·ml-1新霉素抗性平板筛选。利用PCR鉴定方法筛选ytjAα基因缺失株,检测12个抗性转化子确定基因缺失株。将yplQ、ytjAα基因缺失株接种到5%的绵羊血琼脂平板上进行溶血性检测,结果这两个基因缺失株在血平板上仍能够引起溶血,说明单独敲除枯草芽孢杆菌224染色体的yplQ、ytjAα基因对菌株的溶血性无影响或影响不大。本实验是在已经确定yqhB,yrkA,yugS,yhdT,yhdP 5个基因单独作用对其溶血性均无影响的基础上,对枯草芽孢杆菌224溶血样基因继续研究,利用同源重组法构建枯草芽孢杆菌224yplQ、ytjAα基因缺失株,并进行溶血性检测以确定溶血基因或引起溶血的主效基因,对枯草芽孢杆菌224溶血基因的最终确定和溶血作用的研究迈出了关键的一步。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 枯草芽孢杆菌
• 1.1.1 芽孢杆菌的特性及研究现状
• 1.1.2 枯草芽孢杆菌的主要应用
• 1.1.3 枯草芽孢杆菌224 的主要应用
• 1.2 溶血素
• 1.2.1 溶血素的概况
• 1.2.2 溶血素的研究进展
• 1.2.3 大肠杆菌溶血素
• 1.3 基因打靶技术
• 1.3.1 基因打靶技术的理论基础
• 1.3.2 基因打靶操作程序
• 1.3.3 影响打靶效率的因素
• 1.3.4 微生物基因敲除技术
• 1.4 研究的目的与意义
• 2 材料
• 2.1 实验菌种
• 2.2 载体
• 2.3 酶与生化试剂
• 2.4 引物
• 2.4.1 基因鉴定引物
• 2.4.2 同源臂克隆引物
• 2.4.3 重组鉴定引物
• 2.5 主要仪器和设备
• 3 方法
• 3.1 YPLQ 基因敲除研究及其对溶血性影响
• 3.1.1 yplQ 基因的克隆
• 3.1.2 同源前臂yplQ-front 的克隆
• 3.1.3 同源后臂yplQ-back 的克隆
• 3.1.4 yplQ 基因打靶载体的构建
• 3.1.5 枯草芽孢杆菌224 感受态的制备
• 3.1.6 电转化
• 3.1.7 yplQ 基因缺失菌株的筛选及PCR 检测
• 3.1.8 yplQ 基因缺失菌株的核苷酸验证
• 3.1.9 yplQ 基因缺失菌株的溶血性检测
• 3.2 YTJAΑ基因敲除研究及其对溶血性影响
• 3.2.1 ytjAα基因的克隆
• 3.2.2 同源前臂ytjAα-front 的克隆
• 3.2.3 同源后臂ytjAα-back 的克隆
• 3.2.4 ytjAα基因打靶载体的构建
• 3.2.5 枯草芽孢杆菌224 感受态的制备
• 3.2.6 电转化
• 3.2.7 ytjAα基因缺失菌株的筛选及PCR 检测
• 3.2.8 ytjAα基因缺失菌株的核苷酸验证
• 3.2.9 ytjAα基因缺失菌株的溶血性检测
• 4 实验结果
• 4.1 YPLQ 基因敲除研究及其对溶血性影响
• 4.1.1 yplQ 基因的克隆
• 4.1.2 同源前臂yplQ-front 的克隆
• 4.1.3 同源后臂yplQ-back 的克隆
• 4.1.4 yplQ 基因打靶载体的构建
• 4.1.5 yplQ 基因缺失菌株的筛选及PCR 检测
• 4.1.6 yplQ 基因缺失菌株的核苷酸验证
• 4.1.7 yplQ 基因缺失菌株的溶血性检测
• 4.2 YTJAΑ基因敲除研究及其对溶血性影响
• 4.2.1 ytjAα基因的克隆
• 4.2.2 同源前臂ytjAα-front 的克隆
• 4.2.3 同源后臂ytjAα-back 的克隆
• 4.2.4 ytjAα基因打靶载体的构建
• 4.2.5 ytjAα基因缺失菌株的筛选及PCR 检测
• 4.2.6 ytjAα基因缺失菌株的核苷酸验证
• 4.2.7 ytjAα基因缺失菌株的溶血性检测
• 5. 讨论
• 5.1 YPLQ 和YTJAΑ基因的确定
• 5.2 打靶载体骨架质粒的选择
• 5.3 靶基因同源序列的克隆
• 5.4 外源DNA 导入宿主细胞
• 5.4.1 外源DNA 导入宿主细胞途径
• 5.4.2 外源DNA 导入宿主细胞条件
• 5.5 同源重组转化子的筛选与鉴定
• 5.6 同源重组效率
• 5.7 YPLQ 和YTJAΑ基因对BS224 溶血性影响
• 6. 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文