根霉发酵生产富马酸的研究

论文摘要

富马酸又名反丁烯二酸、延胡索酸,是一种重要的有机化工原料和精细化工产品,广泛用于食品、医药、化工、涂料、树脂、增塑剂等领域。本文以试验室保存菌种作为出发菌种,利用紫外线和氯化锂复合诱变,并设计了一种简单准确的初筛方法,利用这种方法大大缩短了筛菌工作时间,辅以培养基的优化,提高了富马酸的发酵产量。经过培养基的初步优化,确定了出发菌株少根霉摇瓶发酵最佳培养基组成为：葡萄糖120g/L,尿素0.5g/L,玉米浆浓度3.0g/L,甲醇60μL/50mL, KH2PO4浓度0.6g/L, ZnSO4·7H2O浓度0.088g/L, MgSO4·7H2O浓度0.4g/L,碳酸钙浓度1.5g/L,接种方法为直接接种法。在基础发酵培养基中,出发菌株摇瓶生产富马酸产量,而在最佳发酵条件下,出发菌株摇瓶发酵生产富马酸产量达到26.22g/L,比未优化前提高了10.6%。以试验室原少根根霉为出发菌种,诱变条件是紫外线照射时间为3mmin,并在4%氯化锂的平板中培养。初筛平板采用塑料小管和抑制剂限制菌体匍匐生长,其生成的富马酸则通过塑料小管底部渗透到指示培养基中,产生变色圈,根据变色圈大小可初步判断诱变株的产酸能力,大大缩短了筛选时间。在葡萄糖浓度为80g/L时,诱变后的3#菌种在发酵72小时后能产生55.02g/L的富马酸,比原菌种的26.22g/L提高了109%。说明利用紫外线照射结合氯化锂的诱变方法提高根霉的富马酸产量是可行的。本研究通过使米根霉在发酵过程中自絮凝形成菌丝球,实现其无载体固定化；在此基础上,开发了无载体固定化米根霉的重复间歇发酵,考察了工艺稳定性,并综合优化了工艺参数和发酵强度。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 富马酸的结构和性质
• 1.2 富马酸及其衍生物的功能和作用
• 1.2.1 药物合成
• 1.2.2 生物材料
• 1.2.3 食品添加剂
• 1.2.4 纸用浆料树脂
• 1.2.5 富马酸酯类
• 1.3 富马酸的生产方法
• 1.3.1 化学合成法
• 1.3.2 生物合成法
• 1.3.3 代谢工程在生物合成富马酸中的应用
• 1.4 富马酸发酵技术进展
• 1.4.1 富马酸生产所用菌种
• 1.4.2 发酵高产菌株的选育
• 1.4.3 挑选优良的出发菌株
• 1.4.4 高产突变株的筛选
• 1.4.5 富马酸的发酵工艺
• 1.5 研究计划部分
• 1.5.1 本课题的创新之处
• 1.5.2 论文选题的立论、目的和意义
• 1.5.3 课题的主要研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 平板培养
• 2.2.2 摇瓶种子培养
• 2.2.3 摇瓶发酵培养
• 2.2.4 根霉生长抑制剂浓度
• 2.2.5 根霉的诱变
• 2.2.6 出发菌株的诱变株筛选
• 2.2.7 发酵筛选试验
• 2.2.8 5L发酵罐培养
• 2.3 分析方法
• 2.3.1 发酵液预处理
• 2.3.2 高效液相色谱（HPLC）系统参数
• 2.3.3 标准曲线
• 2.3.4 生物量测定
• 2.3.5 葡萄糖浓度的测定
• 2.3.6 PH的测定
• 第三章 富马酸发酵工艺优化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 种子培养和发酵方法
• 3.1.4 分析方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 原实验室保存菌种96小时的发酵过程
• 3.2.2 三支产富马酸根霉的对比
• 3.2.3 葡萄糖浓度对发酵进程的影响
• 3.2.4 不同浓度尿素对富马酸发酵的影响
• 3.2.5 甲醇对发酵进程的影响
• 3.2.6 无机盐对菌体发酵的影响
• 3对发酵的影响'>3.2.7 CaCO₃对发酵的影响
• 3.2.8 前体添加的研究
• 3.2.9 接种方法的确定
• 3.3 小结
• 第四章 富马酸高产菌株的诱变筛选
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 种子培养和发酵方法
• 4.1.4 根霉生长抑制剂浓度
• 4.1.5 少根霉的菌株选育
• 4.1.6 出发菌株的诱变株筛选
• 4.1.7 发酵筛选试验
• 4.1.8 分析方法
• 4.2 实验结果与讨论
• 4.2.1 脱氧胆酸钠最小抑制浓度
• 4.2.2 诱变方法的选择
• 4.2.3 出发菌株的诱变株筛选
• 4.2.4 发酵筛选
• 4.2.5 菌种稳定性试验
• 4.3 小结
• 第五章 根霉固定化生产富马酸
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 菌种
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 种子培养和发酵方法
• 5.1.4 分析方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 批次发酵置换液体积对发酵产量的影响
• 5.2.3 首批发酵替换时间
• 5.2.4 替换液中硫酸铵的浓度
• 5.2.5 菌体固定化分批次反应的结果
• 5.3 小结
• 第六章 富马酸发酵罐的发酵进程
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 菌种
• 6.1.2 培养基
• 6.1.3 种子培养和发酵方法
• 6.1.4 分析方法
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 气升式反应器的探索试验
• 6.2.2 5L发酵罐的发酵进程
• 6.3 小结
• 第七章 结论与展望
• 7.1 结论与创新点
• 7.1.1 富马酸产生菌少根霉培养基的初步优化
• 7.1.2 富马酸高产菌株的选育
• 7.1.3 无载体固定化根霉生产富马酸
• 7.1.4 5L发酵罐发酵生产富马酸
• 7.1.5 创新点
• 7.2 展望
• 感谢
• 参考文献
• 研究成果及发表的学术论文
• 作者简介
• 导师简介
• 附件