Ⅲ型登革病毒NS1蛋白特异性单克隆抗体的制备、鉴定及方法学建立

论文摘要

登革病毒（DV）属于黄病毒科黄病毒属,通过埃及伊蚊和白蚊伊蚊传播,登革病毒包括4种血清型（DV1～4）,任何型别的登革病毒感染均可引起一系列的临床症状,表现为隐性感染、发热、登革热（DF）、或更为严重的登革出血热（DHF）和登革休克综合征（DSS）。登革病毒主要流行于热带和亚热带地区,近100多个国家、25亿人口受到威胁,在登革疫区中,多见4型登革病毒交替流行,更增加了不同型别反复感染的危险性。登革热已成为一种严重危害人类健康的蚊媒病毒传染病。初次感染登革病毒所获得的免疫力对于同型病毒的再次感染可产生终身的免疫保护作用,但是对于其它型别登革病毒的再次感染仅能产生部分而且短暂的免疫保护作用。由于存在抗体依赖的感染增强作用,异型DV再次感染是发生DHF/DSS的主要危险因素。目前具有保护性的登革病毒疫苗尚未研制成功,临床上对于登革病毒的感染亦未有特异性的治疗措施。但研究表明及早的临床处理可以减少DHF的发病率和致死率。由于多数登革病毒感染者早期缺乏特异的临床表现,DV感染确诊依赖于实验室诊断手段,从血液或组织中分离到病毒,检测病毒抗原或RNA或者检测血清特异性的抗体。目前,登革病毒的实验室诊断方法主要包括病毒分离、血清学检测和核酸检测。由于4种登革病毒的血清型之间,以及与其它黄病毒成员间存在共同抗原表位,用传统的血清学方法如血凝抑制试验、IgM和IgG抗体捕获ELISA法等检测时存在交叉反应,结果易出现假阳性,并且,血清学检测方法也不能用于早期诊断。病毒分离是登革病毒感染诊断的金标准,并可进一步用于病毒血清型的鉴定,但是该方法费时而且对于实验室的条件要求较高。RT-PCR敏感性高,并且可以鉴定病毒血清型,但因技术要求高、样品易受污染且价格昂贵而使其应用受到限制。因此,需要建立一种简便快速的检测方法用于登革病毒感染的早期分型诊断。迄今为止,仅有本室利用DV1NS1特异性单抗成功建立双抗体夹心ELISA法用于检测病人血清中的DV1NS1抗原,实现了对DV1感染的早期快速分型诊断。登革病毒是一种单股正链RNA病毒,长度11kb,编码3种结构蛋白（C,prM/M,E）和7种非结构蛋白（NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B,NS5）,结构蛋白组成的病毒外膜呈二十面立体对称体,非结构蛋白作为病毒复制复合物的一部分,主要是参与病毒RNA的复制。其中,NS1是DV一种重要的高度保守的糖蛋白,含有一个包含12个连续的半胱氨酸残基的恒定区,具有群特异性和型特异性决定簇,有胞内型、膜型和分泌型,其抗原性很强,含有多个T、B细胞表位,能够诱发细胞和体液免疫应答,且研究发现与DHF/DSS的发病机制有关。有研究发现在登革热患者的早期血中存在高浓度的NS1循环抗原,而检测NS1-IgG可初步进行登革病毒的分型,而本室已获得一组DV1NS1特异性单抗,并成功建立了以单克隆抗体为基础的双抗体夹心捕获DV1NS1抗原的酶联免疫学方法。鉴于登革热流行区大多同时存在4型登革病毒流行,发生不同血清型重复感染的危险性不断增加的特点,为研究DV3感染的早期诊断方法,本研究通过对DV3NS1基因的克隆、蛋白表达及其抗原性鉴定,并通过制备一组特异性抗Ⅲ型登革病毒NS1蛋白的单克隆抗体,建立以单克隆抗体为基础的双抗体夹心捕获DV3NS1抗原的酶联免疫学方法。本研究主要分为三个部分:第一部分:Ⅲ型登革病毒NS1基因克隆及抗原性鉴定用RT-PCR方法扩增Ⅲ型登革病毒NS1全长基因,并定向克隆至原核表达载体pQE31中,pQE31为携带6个组氨酸（His-6）标签的融合蛋白表达载体,通过对表达条件和纯化条件的优化,经尿素和盐酸胍反复洗涤纯化成功获得融合蛋白,命名为DV3NS1。表达蛋白经Western Blot和ELISA鉴定,证明了可与登革病毒交叉性单抗结合,具有良好的抗原性,为进一步研究免疫诊断试剂奠定了基础。第二部分:Ⅲ型登革病毒NS1蛋白特异性单克隆抗体的制备及鉴定本部分研究在成功获得具有抗原性的DV3NS1蛋白的基础上,制备抗Ⅲ型登革病毒NS1蛋白特异性单抗,并对单抗进行免疫学特性研究、抗体识别抗原位点分析以及血清型特异性鉴定。采用重组DV3NS1蛋白与DV3全病毒混合交替免疫的方案分两批免疫BALB/c小鼠,取抗体效价高的小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞融合,对阳性的克隆细胞株进行有限稀释法亚克隆化,经分别以NS1蛋白和DV3病毒为抗原的两种间接ELISA筛选,结合免疫荧光鉴定,最终获得了26株稳定分泌抗NS1蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。26株单抗Ig亚类测定,24株为IgG1,2株为IgG2a。ELISA和IFA鉴定6株特异结合Ⅲ型登革病毒NS1,与其余3型登革病毒不发生交叉反应,为血清型特异性单抗,而WesternBlot鉴定结果为阴性,初步说明它们识别的是构象型表位。经ELISA、WesternBlot和IFA鉴定有7株单抗与所有4型登革病毒交叉反应。采用相互竞争抑制试验分析单抗识别抗原表位,结果显示这一组单克隆抗体除了3株因生物素标记抗体效价很低而未行表位分析外,其余23株单抗可以识别7个以上不完全相同的抗原位点,并均能和天然病毒抗原结合,为下一步建立双抗体夹心抗原检测方法奠定了基础。第三部分:Ⅲ型登革病毒NS1抗原检测方法的建立根据本室Ⅰ型登革病毒抗原检测方法建立的途径,我们将26株单抗进行两两配对,以筛选出最佳抗体配对,用生物素标记每一株单抗,将每一株单抗作为捕获抗体分别与其它株生物素标记单抗作为检测抗体进行相互配对试验,通过检测登革病毒培养上清及检测NS1蛋白的灵敏度和特异性,结合检测正常人血的本底值高低,经反复多次筛选,最终选择了以血清型特异性单抗1D14A2A10为捕获抗体,型交叉性单抗5D32A17为检测抗体组成最佳的抗体对用于构建抗体夹心法。建立的双抗体夹心抗原捕获法检测重组NS1蛋白的灵敏度为0.4μg/ml。进一步检测不同血清型的登革病毒毒株和其它黄病毒的病毒培养液,结果显示,采用血清型特异性单抗作为捕获抗体,型交叉性单抗作为检测抗体建立的双抗体夹心抗原捕获法仅特异的检测到Ⅲ型登革病毒,而与其它病毒无交叉反应,检测方法具有型特异性。另外,由于目前缺乏Ⅲ型登革病毒感染病人血清,我们将模拟病人血清分为酸碱变性处理组和未处理组,用建立的双抗夹心ELISA检测模拟病人血清判断其检测血清中天然NS1蛋白的灵敏度,也发现未处理组的检测灵敏度明显较处理组要高,也进一步说明其中的捕获抗体识别的抗原表位是天然NS1蛋白的构像型表位。本部分研究表明,采用抗体夹心抗原捕获法建立的NS1蛋白检测方法具有较高的敏感性和特异性,将可应用于临床,实现对DV3感染的早期快速分型诊断。综合以上三个部分的研究结果,本研究的结论如下:一、成功获得了具有良好抗原性的Ⅲ型登革病毒NS1重组蛋白,并进一步制备了26株具有血清型特异性和交叉性的Ⅲ型登革病毒NS1单克隆抗体,为免疫诊断试剂的研制、NS1蛋白功能的研究、登革病毒感染的发病机理及疫苗研制等奠定基础。二、本研究获得的26株单克隆抗体,经ELISA及IFA鉴定6株为DV3NS1特异性单抗,而Western Blot鉴定结果为阴性,初步推测其识别的抗原表位是构象型表位。而且,建立的Ⅲ型登革病毒夹心ELISA法检测变性重组NS1蛋白的灵敏度较天然DV3NS1蛋白低,与Western Blot检测结果一致,进一步说明检测方法中的捕获抗体识别的是天然NS1蛋白中的构像型表位,但还待于进一步证实。三、采用血清型特异性单抗作为捕获抗体和型交叉性单抗作为检测抗体,成功建立了Ⅲ型登革病毒双单克隆抗体夹心的NS1抗原检测方法,能特异的检测到Ⅲ型登革病毒中的NS1抗原,与其它3型登革病毒和相关病毒均无交叉反应,具有型特异性,有望应用于登革病毒感染的快速分型诊断或鉴别诊断。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 Ⅲ型登革病毒NS1基因克隆及抗原性鉴定
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 第二部分 Ⅲ型登革病毒NS1蛋白特异性单克隆抗体的制备及鉴定
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 第三部分 Ⅲ型登革病毒NS1抗原检测方法的建立
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 附录
• 成果
• 综述
• 致谢
• 统计学审稿证明