论文摘要
分离培养单个卵裂球生产同卵双胎或一卵多胎动物已有成功报道；提取体外受精胚胎单个卵裂球活体检测着床前胚胎的基因遗传问题是人医临床诊断的热门课题（PGD诊断）；利用小鼠不同发育阶段的早期胚胎分离培养卵裂球获取胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES细胞）的实验研究是近期研究胚胎干细胞来源的热点之一。以上研究内容是近十年来以早期胚胎卵裂球的分离培养为研究手段,为寻求动物快速扩繁新途径、探索人类生前遗传病诊断方式和寻求无伦理争议的人体自身Es细胞生前储备库的有效方法的三个不同目的所开展的研究。以上三方面的研究报道很多,在羊和牛已经获得了来源于2-细胞和4-细胞胚胎的单个卵裂球的活体后代,在兔获得了来源于4-细胞胚胎的单个卵裂球后代,在猪获得了8-细胞单个卵裂球后代。通过活组织检查卵裂球途径建立ES细胞系的成功率很低,而且不是所有的姐妹卵裂球都能建立ES细胞系,由此引发了姐妹卵裂球是否都具有相同的衍生成Es细胞的能力或是否具有不同的命运,卵裂球的选取可能减少供体细胞的发育能力,因此确定随机选取单卵裂球产生ES细胞是否破坏胚胎的完整性以及是否危害胚胎的后续发育,是-个十分重要的问题。小鼠单个卵裂球培养后,ES细胞的建系成功率与胚胎的细胞分裂次数或胚胎细胞的发育阶段具有成反比趋势,这些结果显示出每一个胚胎阶段并不是所有卵裂球,而是只有一个或两个卵裂球有衍生成ES细胞的能力。以上三方面的研究报道均表明各自方向都有成功潜力,成功率很低,影响成功率的焦点问题主要集中在单一卵裂球的质量上,这种质量问题是由于早期胚胎在分裂增殖过程中因时序所致的决定因子分布不均所引起,或是众多研究者沿用的早期胚胎培养基不能满足单一卵裂球更高的无分化性增殖的培养条件所致,前者是遗传性的,后者是后天获得性的问题。本试验针对后者,以昆明小鼠为实验材料,以培养体外受精8-细胞胚胎卵裂球生成囊胚后分离培养出类胚胎干细胞的效果为主要检测目标,从改善体外受精胚胎的早期培养条件入手,探索体外受精8-细胞胚胎单个卵裂球的体外培养体系,因此设计以下3个试验,旨在观察单个卵裂球体外培养条件对其干细胞生产的非遗传因素作用,为ES细胞的研究提供实验依据。试验总结如下：试验一：8-细胞体外受精胚胎单一卵裂球培养基的选择与优化本试验在分析和选择小鼠早期体外受精胚胎培养液的基础上,自制不含抗氧化剂的CZB’培养液,以此为基础培养液,通过添加不同浓度维生素E、半胱氨酸或L-谷氨酰胺等抗氧化剂,观察抗氧化培养对体外受精胚胎2-细胞、4-细胞、8-细胞和桑囊胚发育率的作用,旨在改进小鼠早期体外受精胚胎培养体系的基础上,为选取小鼠体外受精8-细胞胚胎单个卵裂球的培养基奠定基础。结果显示0.15 mg·ml-1L-谷氨酰胺处理组、0.05 mg·ml-1半胱氨酸处理组、100μmol·L-1VE处理组的抗氧化培育效果均优于对照组,能显著提高体外受精胚胎的2-细胞（68.68%、61.35%、67.88%VS 53.14%）、4-细胞（51.77%、49.72%、50.71%VS 27.83%）、8-细胞率（42.18%、41.32%、40.52% VS 17.70%）和桑囊胚发育率（33.75%、32.37%、30.89% VS 12.70%）。结果表明：在实验室自配的CZB’培养液中添加适宜浓度的抗氧化剂对比明小鼠体外受精胚胎进行抗氧化培养效果较好,使用这种抗氧化培养基可以作为体外受精8-细胞单个卵裂球的基础培养液。试验二：8-细胞体外受精胚胎单一卵裂球的培养方法研究在试验一的基础上,本试验选取抗氧化性早期胚胎培养基CZB培养液作为8-细胞胚胎单一卵裂球的培养液,通过改进细胞的共培养体系、比较人工透明带使用效果和观察有限培养液内卵裂球培养密度对其培养效果的影响,从这三个途径入手,研究体外培养单一卵裂球的有效培养方法。结果显示：比较小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblast, MEF）原代（7.33%）、MEF 3代（15.90%）、MEF 6代（0.68%）共培养体系,小鼠子宫内膜细胞共培养体系（16.06%）,小鼠颗粒细胞共培养体系（10.53%）等对单个卵裂球发育的影响,MEF 3代共培养体系和子宫内膜细胞共培养体系更有助于提高8-细胞单个卵裂球发育能力和囊胚率,与对照组相比差异显著（15.90%、16.06% VS 3.48%）;将单一卵裂球放入人工透明带内培养其囊胚发育率没有得到明显改善（16.15% VS 15.87%）,但有透明带培养的多腔囊胚率要显著低于无透明带培养（1.09% VS 4.63%）；在培养微滴中采取10个·20μl-1培养密度培养能显著提高囊胚率（18.44% VS 14.33%）。结果表明：选取MEF 3代共培养体系,用包裹透明带的方法,以10个·20μl-1培养密度培养能显著增强单一卵裂球的体外发育能力和囊胚出现比率。试验三：来源于8-细胞胚胎单一卵裂球囊胚类干细胞的分离、培养与鉴定本试验在获得由单一卵裂球发育而来的小鼠囊胚后,从共培养体系中通过全胚饲养层法培养,再经过显微外科手段挑选出增殖的囊胚内细胞团（Inner cell mass, ICM）集落,进一步通过对内细胞团的离散、分离、培养,最后通过形态学鉴定、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）染色和体外分化试验,初步鉴定来源于小鼠8-细胞体外受精胚胎单一卵裂球的类胚胎干细胞。结果显示：分离所得细胞集落与饲养层界线清楚,表面光滑,细胞致密,集落呈典型的鸟巢状,显微镜下观察,细胞体积小但核很大,符合ES细胞的形态学特征；AKP试剂盒检测,发现该种细胞被染成红色,且周围饲养层细胞不着色；将该种细胞集落挑出,接种于不加白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor, LIF）的ES细胞培养液中,发现该种细胞开始分化。结果表明：这种来源于小鼠体外受精8-细胞胚胎单一卵裂球的细胞集落,经过初步鉴定可以判定为类ES细胞。结论：在分析和选择几种小鼠常用体外受精胚胎培养基的基础上,本试验白制的抗氧化培养基能够有效改进体外受精胚胎的培养效果；以此培养基作为小鼠8-细胞体外受精胚胎单一卵裂球的基础培养液,对单一卵裂球的培养方法进行研究表明,采用MEF 3代共培养体系,将单一卵裂球放入人工透明带内培养和在培养微滴中采取10个·20μl-1培养密度培养的方法能够显著提高小鼠8细胞体外受精胚胎单一卵裂球发育至囊胚的比率：从这种来源于小鼠体外受精8-细胞胚胎单一卵裂球的细胞集落中能够分离培养出界线清楚、表面光滑、细胞致密、呈典型鸟巢状的集落,通过形态学鉴定、AKP染色和体外分化试验初步鉴定为类胚胎干细胞。
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标签：昆明小鼠论文; 细胞体外受精胚胎论文; 抗氧化体外受精胚胎培养基论文; 单个卵裂球论文; 类细胞论文;